时间:2022-03-21 16:39:39
导言:作为写作爱好者,不可错过为您精心挑选的10篇大一学习计划书,它们将为您的写作提供全新的视角,我们衷心期待您的阅读,并希望这些内容能为您提供灵感和参考。
声乐班以提高学生的音乐综合素质与兴趣为目的,通过形象生动的教学形式,使学员了解歌唱基本原理,掌握一定的音乐基础知识和歌唱的基本技能,激发学员热爱音乐艺术,培养学员正确的审美意识与积极、健康、活泼、向上的审美情趣。教学内容包括基本歌唱发声技巧、视唱练耳、基本乐理、歌唱表演,歌唱姿态与舞台风度。
二、 辅导方法:
统一视唱练耳练习:每周一中午12点40,教学楼108教室,由王老师统一带领练习;或由器乐组同学帮助在饭堂三楼琴房练习。
声乐组成员自主练习时间:每周2晚7点在饭堂三楼琴房(成员也可以根据自己的实际情况在课外活动时间练习)。
训练统一发音位置,练习合理呼吸,咬字吐字清晰,声音独立稳定。练习曲以简到难,有小到大,循序渐进。
三、小组成员的考核:
关键词:头顶一颗株; 学习; 记忆; 抗氧化酶; 超氧化物歧化酶; 谷胱甘肽过氧化物酶
Effects of Trillium tschonoskii Maxim on Learning and Memory and Anti-oxidase in Rats
Abstract:ObjectiveTo study the effect of Trillium tschonoskii Maxim injection on the learning and memory and on the expression of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in serum, liver, kidney, hippocampus, cortex of aging rats.MethodsRats were randomly pided into five groups, control group, model group, Trillium tschonoskii maxim injection small dose group, middle dose group and large dose group. Rat model of acquired memory deficiency induced with haloperidol was employed. Electricity stimulated jumping stand was used for observation on rat behavior change and meanwhile concentrations of SOD and GSH-Px in different organs of the animal were detected.ResultsIn contrast with model groups, Trillium tschonoskii maxim injection at different dosage could maintain learning and memory, significantly increase the concentrations of SOD and GSH-Px in different tissue of the rats.(P
Key words:Trillium tschonoskii Maxim; Learning; Memory; Anti-oxidase; Superoxid dismutase; Glutathione peroxidase
头顶一颗株又称延龄草Trillium tschonoskii Maxim,为百合科延龄草属植物,以根入药,含有薯蓣皂素、甾醇、甾酮等化学成分,具有镇静、止痛、止血作用,主要用于治疗眩晕头痛、神经衰弱、跌打损伤、月经不调、崩漏等疾病[1]。 现代医学研究认为,中枢神经系统功能退行性病变是人体衰老的关键,并与代谢产生的氧自由基(oxygen free radicals)慢性损伤或抗氧化酶不足密切相关。本实验用头顶一颗株注射液腹腔注射,通过对各组大鼠行为学观察和组织SOD,GSH-Px含量测定,探讨头顶一颗株注射液对大鼠学习记忆能力及抗氧化酶的影响,从而进一步探讨其改善中枢神经系统功能抗衰老作用机制。
1 材料与方法
1.1 头顶一颗株注射液制备头顶一颗株由恩施中药材生产GAP(质量管理规范)示范基地提供,采用水提醇沉法制成含生药30%的注射液,瓶装密封消毒备用。
1.2 药品与仪器氟哌啶醇注射液(湖南洞庭药业股份有限公司生产), SOD、GSH-Px试剂盒(由南京建成生物工程研究所提供),回避反应箱(由华中科技大学同济医学院病理生理系提供),GL-20G II型高速低温离心机,UV-2450分光光度仪,水浴箱。
1.3 电跳台行为学训练及测试实验装置为30 cm×30 cm回避反应箱,箱底为铜栅,可通刺激电流。另有一高5 cm,顶端直径为5 cm的橡胶圆台作为避电击平台,固定放置在箱内一角的铜栅上,大鼠可在圆台上停留以回避电击。实验开始时,先将大鼠轻放于回避反应箱内,使其适应3~5 min,以消除探究反应。尔后底部铜栅通电(36 V)2 s,大鼠在受电击刺激中逐渐学会跳上平台回避电击。多数大鼠可能再次或多次跳至铜栅上,受到电击后又重新跳回平台,如此训练3 min,并记录每只鼠受电击数或犯错次数,以此作为学习成绩。末次给药后,再测试行为学改变,记录3 min各鼠跳下平台的错误次数和第一次跳下平台的潜伏期。
1.4 动物分组与用药雄性Wistar大鼠50只,鼠龄40~50周,体重300~350 g,由华中科技大学同济医学院动物中心提供。随机分为对照组、模型组、头顶一颗株高剂量组、中剂量组和低剂量组,每组10 只。模型组按1 g/kg体重腹腔注射氟哌啶醇注射液,头顶一颗株高、中、低剂量组分别在注射氟哌啶醇的同时,按7.2,3.6,1.8 g/kg体重腹腔注射头顶一颗株注射液,对照组每天等量腹腔注射生理盐水,Bid,连续用药7 d。
1.5 组织SOD,GSH-Px测定行为学测试结束后断颈处死大鼠,迅速取血及各种组织,血液离心取血清,组织制成10%匀浆,备用。SOD,GSH-Px测定,按试剂盒说明书进行,蛋白定量采用双缩脲法测定。
1.6 统计方法所有结果都用SPSS统计软件进行处理,计量资料用±s表示,在对数据进行分析的过程中,发现个别数据不符合ANOVA比较的要求,而用非参数进行比较分析。
2 结果
2.1 头顶一颗株对大鼠学习记忆能力的影响 电跳台行为学测试结果显示,头顶一颗株各剂量组与模型组比较均能延长实验大鼠的跳台潜伏时间,减少3 min犯错次数, 高、中剂量尤其明显(P
2.2 头顶一颗株对大鼠血及组织SOD,GSH-Px影响从表2和表3可见:头顶一颗株注射液各剂量组与模型组比较均能提高血液、海马、脑皮质及肝肾SOD,GSH-Px表达值,高、中剂量组作用明显(P
表1 头顶一颗株对大鼠学习记忆能力的影响(略)
与模型组比较,*P
表2 头顶一颗株对大鼠血及组织SOD的影响(略)
与模型组比较,*P
表2 头顶一颗株对大鼠血及组织GSH-Px的影响 (略)
与模型组比较,*P
3 讨论
衰老(Senility)是人体一种全身性生理变化过程,各系统、器官、组织和细胞都会出现这种过程,其机制复杂,并与多种因素有关。Lustbader等研究发现,阿尔茨海默病的发病机制与氧化应激有关,氧化应激通过氧自由基损伤神经元细胞,促进神经元细胞凋亡或死亡,引起神经系统功能减退[2]。SOD和GSH-Px是重要的抗氧化酶系,普遍存在于人体各组织中,包括血液、肝脏、线粒体和细胞质,有对抗自由基损伤和清除氧自由基、降低细胞内H2O2水平、减少自由基和过氧化物蓄积的作用。氧自由基被SOD转变为H2O2后,GSH-Px可继续作用在H2O2上,使之转变成完全无害的水和氧。因此SOD,GSH-Px表达变化,已成为检测衰老因素最为敏感和可靠的指标[3]。已有实验研究报道,根据氟哌啶醇可使实验动物产生僵住症(强直性昏厥,catalepsy)的原理,用氟哌啶醇进行大鼠腹腔注射,对SOD和GSH-Px有抑制作用,是很好的动物老化造模剂[4]。本实验用氟哌啶醇造模,观察、探讨头顶一颗株对大鼠行为学变化及在不同组织对SOD,GSH-Px表达作用的影响,结果表明:头顶一颗株能维持实验大鼠学习记忆能力,显著提高实验大鼠血、肝、肾、海马、脑皮质SOD,GSH-Px表达量,具有上调抗氧化酶表达、改善记忆抗衰老作用。
参考文献:
[1] 谢宗万,范崔生,朱兆仪,等. 全国中草药汇编,第2版[M].北京:人民卫生出版社,1996:225.
1 材料与方法
11 党参注射液制备
富硒板党[恩施板桥乡中药材生产质量管理规范(GAP)示范基地]。采用水提醇沉法制成含生药30%的注射液,瓶装密封消毒备用。用双道束原子荧光光谱法测定硒的含量为072?μg/ml。
12 药品及实验仪器
氟哌啶醇注射液(湖南洞庭药业股份有限公司);SOD、GSHPx试剂盒(南京建成生物工程研究所);回避反应箱(华中科技大学同济医学院自制);GL20G II型高速低温离心机,UV2450分光光度仪,水浴箱。
13 大鼠电跳台行为学训练及测试
跳台实验参照文献〔3〕进行。末次给药15?min后将大鼠轻放于回避反应箱内训练,适应环境3?min,随后底部铜栅通电(36V)2?s,训练时间为3?min。24?h后再进行行为学测试,记录各鼠第一次跳下平台的潜伏期和3?min跳下平台的错误次数。
14 实验动物分组
雄性Wistar大鼠50只,鼠龄40~50周,体重300~350?g(华中科技大学同济医学院动物中心),随机分为对照组、模型组、富硒板党高剂量组、中剂量组和低剂量组,每组10只。模型组按1?g/(kg·bw)腹腔注射氟哌啶醇注射液,富硒板党高、中、低剂量组分别在注射氟哌啶醇的同时,按72,36,18?g/(kg·bw)腹腔注射富硒板党注射液,对照组每天等量腹腔注射生理盐水,各组用药为2次/d注射,连续用药7?d。实验动物造模参照文献〔4〕。
15 SOD、GSHPx测定
行为学测试结束后断颈处死大鼠,迅速取血及各种组织,血液离心取血清,组织制成10%匀浆,备用。SOD、GSHPx测定,按试剂盒说明书进行,蛋白定量采用双缩脲法测定。
16 统计分析
采用SPSS115统计软件进行方差分析(ANOVA),计量资料用均数加减标准差表示,对不符合ANOVA的数据,用非参数检验(KruskaiWallis Test)进行比较分析。
2 结果
21 富硒板党对大鼠学习记忆能力的影响
富硒板党各剂量组与模型组比较均能延长实验大鼠的跳台潜伏时间,减少3?min犯错次数,高、中剂量尤其明显(P
22 富硒板党对大鼠血及组织SOD、GSHPx影响
富硒板党注射液各剂量组与模型组比较均能提高血液、海马、脑皮质及肝肾SOD、GSHPx表达值,高、中剂量组作用明显(P
3 讨 论
多数学者认为,体内自由基的浓度与学习记忆功能密切相关,随着年龄的增加,由于抗氧化酶活性不断下降,体内产生的过量氧自由基无法及时清除,造成细胞代谢和功能形态的改变,导致细胞的衰老。SOD和GSH-Px是重要的抗氧化酶系,能清除氧自由基、降低细胞内H2O2水平、减少自由基和过氧化物蓄积导致的细胞毒性作用〔5〕。肖本见等研究表明,富硒板党能减弱苯异丙腺苷致小鼠学习记忆障碍,对小鼠具有益智和抗氧化作用〔6〕。本实验结果表明,富硒板党能减弱氟哌啶醇致大鼠的学习记忆障碍,维持实验大鼠学习记忆能力,显著提高实验大鼠血、肝、肾、海马、脑皮质SOD、GSHPx的表达量,与肖本见等〔6〕的研究一致,说明富硒板党具有清除氧自由基、改善记忆抗衰老、预防老年性痴呆等作用。其作用机制可能与富硒板党所含胆碱、多糖及微量元素硒有关。为进一步开发及其临床应用、健康保健等方面提供了药理学实验依据。
【参考文献】
〔1〕殷智.党参商品名称辨析[J].湖北中医杂志,2001,23(11):49-50.
〔2〕肖培根.新编中药志[M].北京:化学工业出版社,2001,1:811-812.
〔3〕H Gerhard vogel(著),杜冠华(译).药理学实验指南—新药发现和药理学评价[M].北京:科学出版社,2001:444-445.
DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2013.07.015
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2013)07-0038-05
Change of Capillary Pericapillary Cells in Rats with Myocardial Infarction and Effect of Supplementing Qi and Activating Blood Circulation Herbs HUANG Kun, YANG Dan-dan, GUO Shu-wen, SUN Qing, ZHANG Lu, QI Xin, WAN Ting, ZHENG Cheng-long (Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029 , China)
Abstract:Objective To observe the change of capillary pericapillary cells in rats with myocardial infarction and the influence of supplementing qi and activating blood circulation herbs, and explore its mechanism of improving myocardial perfusion. Methods The rat model was established by ligaturing the left anterior descending coronary artery. On the base of ECG evaluation, successfully modeled rats were randomly divided into the model group, group treated with supplementing qi and activating blood circulation Chinese medicine (activating blood and supplementing qi group), group treated with Perindopril (Perindopril group), group treated with Tongxinluo Capsules (Tongxinluo group). The sham-operation group was taken as the control. There were totally 5 groups. The model group and the sham-operation group were treated with normal saline. The changes of myocardial capillary density (MCD) and number of pericapillary cells on the 7th, 28th day after medicinal administration were observed. Results On the 7th and 28th day, the MCD decreased significantly and the number of capillary pericapillary cells increased significantly in the model group compared with the sham-operation group (P
Key words:supplementing qi and activating blood circulation herbs;myocardial capillary density;number of pericapillary cells;myocardial infarction;rats
研究显示,心肌梗死患者虽然经过搭桥或支架置入术后使梗死相关冠脉再通,或经冠脉造影证实已达TMI3级血流的梗
基金项目:国家自然科学基金(81173142)
通讯作者:郭书文,E-mail:
死相关血管,有超过25%的患者心肌组织水平的血流灌注并未恢复[1]。因此,减少缺血心肌再灌注损伤、保持心肌微血管的完整性、改善缺血心肌血供状态、恢复心肌细胞功能,是目前研究的热点问题。
前期的系列研究结果显示,益气活血方能明显促进大鼠缺血心肌微血管生成而改善心肌缺血,并能抑制心肌细胞凋亡,对相关蛋白及细胞因子有显著调节作用[2-4]。本研究采用结扎冠状动脉的方法建立大鼠急性心肌梗死后心衰模型,利用免疫组织化学方法观察模型大鼠心肌毛细血管周细胞的变化,以及益气活血中药对其的影响,进一步探讨益气活血中药改善心肌血流灌注的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
健康雄性SD大鼠,体质量(200±20)g,清洁级,8周龄,中国科学院动物研究所提供,许可证号:SCXK(京)2012-0001。
1.2 药物
益气活血药由黄芪、人参、当归、川芎、三七粉等组成。根据前期研究结果[5-6]选择益气活血药(2∶1)的剂量组合[5-6]。依口服剂工艺制备,按处方比例称取中药材,加9倍量水,煎煮2次,每次2.5 h,共5 h,水煎液过滤,浓缩,加乙醇调含醇量至50%,过滤,回收乙醇,过滤,调整浓度为相当原药材2 g/mL,北京中医药大学药厂提供。
对照药物选用通心络胶囊,石家庄以岭药业股份有限公司生产,批号110723-120116;培哚普利片,施维雅(天津)制药有限公司,批号P2009971052951。
1.3 试剂与仪器
BA3414 兔抗鼠CD34抗体(武汉博士德生物工程有限公司产品),BM0002小鼠抗α-SMA抗体(武汉博士德生物工程有限公司产品),血清内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO),南京建成生物工程公司提供。RSP1002型小动物呼吸机(Kent Scientific Corporation)。
2 实验方法
2.1 造模
采用左冠状动脉前降支结扎方法[7]。用1%戊巴比妥钠腹腔注射(40 mg/kg)麻醉后,背位固定,行气管插管,连接小动物呼吸机,在左侧第3、4肋间切开皮肤,钝性分离肌层,打开胸腔,用开胸器推开胸腺扩大手术视野,充分暴露心脏,用带线缝合针在左心耳与肺动脉圆锥之间于左心耳下约2 mm处,无张力的状态下将左前降支连同少量的心肌组织一起结扎,然后迅速将心脏复位,关闭胸腔。全部手术过程在30 min内完成,严格无菌操作。术后连续3 d肌肉注射青霉素预防感染。以结扎部位以下心肌变灰白、搏动减弱、心电图肢体导联出现ST段弓背向上明显抬高为造模成功的标志。假手术组手术过程相同,仅绕过左冠状动脉,打松结。
2.2 分组与给药
将大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、中药组、培哚普利组、通心络组。
各组于造模的第1日开始分别灌胃相应药物,每日1次。通心络组每日给予通心络胶囊30 mg/kg体质量,培哚普利组每日给予培哚普利片0.72 mg/kg体质量,益气活血组每日给予益气活血中药21 g/kg体质量[5-6]。各干预药物均溶于无菌蒸馏水中,在保证药物剂量的前提下,调整浓度使每只动物给药容积均为10 mL/(kg・d)。假手术组和模型组每日以相同容积无菌蒸馏水灌胃。连续灌胃28 d。
2.3 标本采集
称取大鼠体质量,用1%戊巴比妥钠麻醉,剪开腹腔,从腹主动脉取血,分离出血清待测。然后剪断肋骨和胸肌,暴露胸腔取出心脏,用生理盐水洗去血污,剔除血管、脂肪等非心肌组织,从左心室最大横径处切开,将切好的下半部分心脏放入预先准备的4%多聚甲醛液中固定备用,进行常规组织学方法处理,制作石蜡切片。据各组大鼠在实验过程中的成活数量分别观察第7、28日2个时间点指标的变化情况。
2.4 心肌病理形态学观察
将心肌组织用不同浓度酒精梯度脱水,二甲苯透明,浸蜡、包埋、切片,脱腊,二甲苯透明,HE常规染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,树胶封固,光学显微镜观察。
2.5 心肌毛细血管密度
石蜡切片脱蜡至水;3%过氧化氢室温孵育8 min,以消除内源性过氧化物酶的活性;蒸馏水冲洗3次(每次2 min),电炉加热沸腾后断电,间隔7 min,反复2次,冷却后PBS(pH 7.2~7.6)洗涤2次,滴加5%牛血清白蛋白封闭液,室温20 min,甩去多余液体,滴加CD34一抗(浓度为1∶100),4 ℃过夜,第2日早晨滴加生物素山羊抗小鼠IgG,室温20 min,PBS洗3次(每次2 min),滴加SABC,室温20 min,PBS洗4次(每次5 min),DAB显色,取1 mL蒸馏水,A、B、C试剂各加1滴,混匀后加至切片,室温显色,镜下控制时间,蒸馏水冲洗,苏木素轻度复染,1~2 s即可,梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固。
2.6 免疫组化染色法检测周细胞
石蜡包埋,切片(厚度4 ?m,每只鼠各取3张切片),脱蜡,高温高压抗原修复,喷气后计时2 min,自然冷却,水洗。4 ℃下于1∶300 α-SMA单克隆抗体孵育24 h,每张切片滴加50 ?L EnVisionTM试剂,室温下孵育30 min。滴加新鲜配制的显色剂(DAB),苏木素复染。显微镜下观察,胞浆显棕黄色者为阳性细胞。按下法计数:先在100×视野下随机选择血管密度高的5个区和血管密度低的5个区作为计数部位,后在400×视野下计数微血管旁胞质出现棕黄色颗粒的周细胞数,每只大鼠计数20个视野,最后以平均每个视野(400×)的周细胞数表示。小动脉平滑肌细胞亦为α-SMA阳性表达,根据血管壁厚度及结构可与周细胞相区别,此类阳性细胞不在计数范围内。
2.7 血清内皮素-1、一氧化氮测定
采用双抗体夹心ELISA法测定各组大鼠血清ET-1、NO的变化,具体方法严格按试剂盒说明操作。根据各组大鼠在实验过程中的成活数量分别观察第7、28日2个时间点指标的变化情况。
3 统计学方法
用SPSS16.0统计软件进行分析。一般资料采用描述性分析,计量资料以―x±s表示,计数资料以频数及百分数描述;多个样本计数资料用χ2检验,计量资料符合正态性分布采用t检验,如不符合正态性分布采用非参数检验,比较各项指标在治疗前后之间的差异,多组间差异性统计采用方差分析,若方差不齐,则用Games-Howell分析,双侧检验。P
4 结果
4.1 模型建立情况
采用冠状动脉结扎法致大鼠急性心肌梗死后,肢导Ⅱ导联心电图ST段呈弓背向上抬高,缺血心肌很快变苍白色。共手术100只,造模成功81只,死亡19只,其中手术中死亡8只,急性心肌梗死造模成功后24 h内死亡3只,给予药物治疗后死亡3只,注射麻药后行心脏超声检查后死亡5只,死亡原因为呼吸停止、室颤和大出血,造模成功率81.0%。第7日观察大鼠42只,第28日观察大鼠39只。
4.2 各组大鼠心肌形态学观察
第7日:假手术组大鼠心外膜未见纤维素渗出及未见炎细胞浸润;模型组心肌梗死区炎症反应明显,有泡沫状组织细胞聚集,大量中性粒细胞浸润,心肌纤维断裂、排列紊乱,坏死的心肌组织由新生的肉芽组织取代;梗死区边缘有充血、出血及炎细胞带,心外膜有炎性及纤维素性渗出物。培哚普利组病理改变与模型组相似,但病变范围较模型组明显减小。通心络组病理改变与模型组相似,但病变范围较模型组明显减小,较培哚普利组病变范围小。益气活血组病理改变与模型组相似,但病变范围较模型组明显减小,较培哚普利组及通心络组病变范围较小。见图1。
第28日:假手术组大鼠心外膜未见纤维素渗出及未见炎细胞浸润。模型组大鼠心肌梗死区由纤维母细胞、纤维细胞及致密的胶原纤维束组成,呈束状或平行排列,胶原纤维束之间有极少残存的心肌组织,炎性细胞浸润明显减少,地图状瘢痕组织形成;心室腔扩大,室壁变薄。培哚普利组大鼠病理改变与模型组相似,但病变范围较模型组明显减小,且梗死区有岛状或细带状的心肌组织。通心络组大鼠病理改变与模型组相似,但病变范围较模型组明显减小,且梗死区有岛状或细带状的心肌组织,但较培哚普利组病变范围大。益气活血组大鼠病理改变与模型组相似,但病变范围较模型组明显减小,且梗死区有岛状或细带状的心肌组织,但较培哚普利组病变范围大。见图2。
假手术组 模型组
益气活血组 培哚普利组 通心络组
图1 第7日HE染色大鼠心肌病理形态(×50)
假手术组 模型组
益气活血组 培哚普利组 通心络组
图2 第28日HE染色大鼠心肌病理形态(×100)
4.3 益气活血中药对心肌梗死大鼠血清内皮素-1、一氧化氮水平的影响
与假手术组比较,模型组大鼠血清ET-1含量明显升高,NO水平下降(P
表1 各组大鼠血清ET-1、NO水平比较(―x±s,pg/mL)
组别 术后第7日 术后第28日
只数 ET1 NO 只数 ET1 NO
假手术组 10 5.37±1.06 31.12±2.57 9 6.38±1.73 30.38±4.00
模型组 7 13.67±1.68## 19.41±3.24## 7 14.60±2.38## 16.23±3.05##
益气活血组 9 8.06±1.21** 41.71±4.43** 8 8.97±1.07** 40.11±5.51**
培哚普利组 8 10.65±1.12** 33.02±2.68** 8 7.30±1.37** 45.26±6.60**
通心络组 8 9.87±0.73** 37.76±3.34** 7 9.57±1.57** 35.06±5.20**
注:与假手术组比较,##P
4.4 益气活血中药对心肌梗死大鼠毛细血管密度的影响
在病理图像分析系统下测定各组大鼠心肌梗死边缘区平均毛细血管密度(MCD)。第7日:模型组较假手术组心肌梗死边缘区MCD明显降低(P
表2 各组大鼠心肌MCD比较(―x±s)
组别 n 第7日 第28日
假手术组 20 612.79±33.35 611.11±25.67
模型组 20 533.67±20.27## 493.27±19.38##
益气活血组 20 1178.50±33.27** 1051.30±30.12**
培哚普利组 20 1010.10±33.27** 1099.30±33.98**
通心络组 20 1094.30±33.12** 974.75±35.41**
4.5 益气活血中药对心肌梗死大鼠毛细血管周细胞计数影响
第7日:模型组较假手术组心肌梗死边缘区周细胞计数明显增加,益气活血中药组、培哚普利组、通心络组与模型组比较,梗死边缘区的周细胞计数减少(P
表3 各组大鼠心肌周细胞计数比较(―x±s,个)
组别 n 第7日 第28日
假手术组 20 0.8±0.84 1.2±0.84
模型组 20 8.2±1.30## 14.0±1.58##
益气活血组 20 4.2±0.84* 4.4±1.14**
培哚普利组 20 5.8±0.84** 3.6±1.14**
通心络组 20 4.4±0.55** 5.8±1.30**
注:与益气活血组比较,P
P
5 讨论
临床研究表明,急性心肌梗死患者多存在“气虚血瘀”的中医病理[8]。实验的中药组方中,生晒参、黄芪大补元气、广益五脏,针对气虚的主要病机;三七、川芎、当归为臣,活血通络、止血消瘀。诸药相合,气行则血行,血行则气实,诸药合用,标本兼治,相得益彰,共奏益气活血、化瘀通络之功效。
冠脉微血管结构完整性与功能正常,是确保心肌收缩力储备和局部功能恢复的先决条件,是心肌存活的必备条件,当发生微小动脉和阻力血管的功能及结构变化时,冠脉血流速率和血流储备的变化可引起心肌缺血。低灌注梗死区和正常心肌之间的慢复流区域毛细血管内皮肿胀、突出甚至脱落,受周边的坏死组织压迫,毛细血管内皮细胞功能和结构完整性受损,心肌毛细血管周细胞功能失调。血管壁在结构上由血管内皮细胞和血管周围细胞组成,它们分别构成血管的内外壁。周细胞又叫壁细胞,可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、软骨细胞、平滑肌细胞等,具有收缩能力,从而调节微循环的灌流量和通透性[9-10]。
有研究显示,早期心肌缺血缺氧性坏死中周细胞数量在4 h后明显增多,12 h后开始下降,48 h后显著低于正常水平,推测周细胞作为心肌中的间质细胞可能是心肌纤维化发生发展中的主要效应细胞[11]。本实验结果表明,使用益气活血中药后,毛细血管周细胞的计数减少,与模型组比较差异有统计学意义(P
本实验结果显示,益气活血组较模型组心肌梗死边缘区域MCD明显增加,可见周细胞对毛细血管生长起到调控的作用。研究发现新生血管的生长和维持主要由周细胞的募集和分化所推动[12-13]。周细胞募集并伴随发生基底膜重塑[14-15]。可见,周细胞的募集对血管新生是必不可少的。
此外,益气活血中药可提升内皮分泌NO水平,并相应降低ET-1水平。NO和ET-1是由血管内皮细胞分泌的一对作用相反的血管活性分子,NO的含量与生物活性的变化能够反映内皮功能的状态。与益气活血组模型组比较,ET-1下降,NO升高,说明益气活血中药具有保护血管内皮功能的作用。
总之,益气活血中药可以通过降低心肌梗死大鼠毛细血管周细胞计数,维持血管的相对完整性,改善局部微循环的血流,减少梗死面积,并促进血管新生,调节NO/ET-1的平衡,从而达到改善局部心肌血供的目的。
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随着生活节奏加快,社会竞争日益激烈,越来越多的人们感受到社会生活更为紧张,由此引发的情绪与心理问题日益增多。愤怒是负性情绪的核心[1],与健康和疾病的关系极为密切,有国外学者指出[2],具有愤怒倾向的人群更易出现健康问题。中医认为,肝主疏泄,在志为怒,怒伤肝,长期或剧烈的愤怒情绪会阻碍肝疏泄气机的功能,使气机逆乱。头为诸阳之会,五脏精华之血,六腑清阳之气皆汇聚于脑,方有神明之用,若气机逆乱,气血不能正常输布于脑,脑失濡养日久则可能导致脑老化加速。那么,愤怒情志对脑老化进程究竟有何影响?其机制如何?本研究借助动物实验探讨慢性愤怒应激对大鼠脑老化进程的影响及其部分神经内分泌机制。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 Wistar雄性大鼠56只,SPF级3月龄,购于北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(京)2006-0009),体重为360±10g。在河南省食品药品检验所动物实验中心屏障环境设施动物实验室(SYXK(豫)2005-0011)进行实验,并由该实验室提供标准实验动物灭菌饲料。正常饲养3日后,按体重随机分为空白对照组、D-gal衰老及脑老化模型组(简称模型组)、慢性愤怒应激组(简称愤怒应激组)三组,每组14只,其余14只作为攻击鼠。各组分笼饲养,自由饮食饮水。(注:模型组予以注射D-gal,愤怒应激组在注射D-gal基础上引入愤怒刺激。)
1.2 主要试剂及仪器 大鼠血浆E酶免试剂盒(美国R&D公司,批号:09-05);大鼠血浆NE酶免试剂盒(美国R&D公司,批号:09-05);大鼠血浆DA酶免试剂盒(美国R&D公司,批号:09-05);680自动酶标分析仪(美国伯乐);1575自动酶标洗板机(美国伯乐);HPS-250生化培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);Morris水迷宫(成都泰盟科技有限公司)。
1.3 D-gal衰老模型 参考李文彬等[3] D-gal衰老及脑老化造模方法,模型组和愤怒应激组注射D-gal溶液,制作衰老及脑老化模型。具体方法:将D-gal溶于生理盐水,浓度为2%,注射容量为0.01ml?g-1,每日1次,颈后部皮下注射,空白对照组注射同体积生理盐水,连续6周。每周测体重1次,依所测体重计算注射容量。
1.4 愤怒应激组引入愤怒刺激的方法 课题组在夹尾间接激怒法[3]基础上,受传统直接电击法的启发,创立一种新型诱发大鼠愤怒情绪的方法――间接电击激怒法。自实验第三周始每天下午3点对愤怒应激组大鼠进行愤怒刺激。具体方法:使用特制电刺激仪作为电刺激工具,把愤怒应激组大鼠单独放入特制金属笼内,再随机放进一只攻击鼠,用一端电极触碰攻击鼠前部(电极的另一端与金属笼相连以构成回路),攻击鼠受电击被激惹,对愤怒应激组大鼠发起攻击,双方互相撕咬、对峙,产生愤怒心理和行为。频率为1~2次/min,每天刺激15min,连续4周。最后攻击鼠丢弃不用。
1.5 标本采集及制备 实验至第37天始,进行Morris水迷宫测试,为期6天。至第42天完成实验后,禁食24小时,按每100g体重注射0.5~1.5ml 20%乌拉坦,麻醉后经腹主动脉取血4~5ml,静置、离心,吸取上清液,-70℃保存,用于测定血浆肾上腺素(epinephrine, E)、去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)、多巴胺(dopamine, DA)。
1.6 统计学方法 实验结果用SPSS 13.0统计软件包进行处理。数值变量以 进行统计描述。数值变量组间均数差异的比较,正态分布和方差符合齐性
检验后,采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较用LSD法,P
2 结果
2.1 慢性愤怒应激对D-gal大鼠空间学习记忆能力的影响表1显示的是Morris水迷宫第6天的测试结果:愤怒应激组较模型组大鼠寻台时间(searching platform latency, SPL)明显延长(P
2.2 慢性愤怒应激对D-gal大鼠血浆儿茶酚胺的影响 与模型组相比,愤怒应激组大鼠血浆E、NE、DA含量均明显升高(P
3 讨论
学习记忆能力减退是衰老尤其是脑老化的重要表现,临床上脑老化患者可呈现进行性精神状态衰变,包括远近期记忆力障碍、情绪改变、分析判断能力衰退、行为失常等。本研究用Morris水迷宫检测动物空间定位与学习记忆能力,结果显示:愤怒应激组较模型组SPL明显延长,提示持续的愤怒应激加重D-gal衰老大鼠空间学习能力减退的程度,加速大鼠脑老化进程。
E是由肾上腺髓质分泌的一种儿茶酚胺激素,在应激状态、内脏神经刺激和低血糖等情况下,释放入血液循环,促进糖原分解并升高血糖,促进脂肪分解,引起心跳加快。当人体经历某些刺激(如兴奋,恐惧,紧张等)时,分泌E,促使呼吸加快以提供大量氧气,同时引起心跳与血液流动加速,瞳孔放大,为身体活动提供更多能量,使反应更加快速。
NE属于神经递质,也是一种激素,循环血液中的NE主要来自肾上腺髓质。目前认为中枢的NE神经元与交感-肾上腺髓质系统是两个独立的系统,但在情绪活动加剧时,两者的活动都增强。NE系统适度兴奋可能产生兴奋和欣快的情绪,过度兴奋则可能导致躁狂和攻击行为,说明NE水平变化与情绪变化密切相关。血中E、NE水平,目前被公认为反映交感-肾上腺髓质功能状态的可靠指标。本实验结果显示:接受愤怒刺激的愤怒应激组大鼠血浆E、NE含量明显上升,可能是由于愤怒激活了交感-肾上腺髓质系统,导致大量的E、NE释放入血。
DA由脑内分泌,属于儿茶酚胺类,参与调节机体的觉醒、注意力和精神情绪状态。中枢内多巴胺系统主要参与对躯体运动、精神情绪活动、垂体内分泌功能以及心血管活动等的调节。在应激情况下,DA神经元生理活动加强,当应激的强度或持续时间超过机体耐受能力时,将导致认知功能及操作能力下降。酪氨酸的充足供应能增强DA的合成和释放,在一定程度上拮抗应激对中枢DA神经元的损害[4]。本研究中,模型组DA较空白对照组含量有下降趋势,提示衰老有阻碍DA合成,降低认知能力的倾向;愤怒应激组DA含量较模型组明显升高,提示愤怒情绪可引起血中DA含量增加。
三种儿茶酚胺E、NE、DA均可兴奋HPA轴功能,导致HPA轴亢进,进而引起血中促肾上腺皮质激素(adrenocorticotrophic hormone, ACTH)、糖皮质激素(cortisol, CORT)浓度上升。海马上糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)表达最高,血中高浓度的CORT极易与GR结合,引起GR损伤,进而导致海马组织受损[5-6]。海马是学习记忆的关键部位,海马损伤必将使大鼠学习记忆能力下降,加速脑老化进程。本研究中,长期愤怒应激使大鼠血浆E、NE、DA含量上升,且SPL明显延长,表明血浆儿茶酚胺水平升高,大鼠学习记忆能力下降,提示出现脑老化迹象。因此可以认为,愤怒情绪长期积累引起血浆儿茶酚胺含量升高,从而进一步激活HPA轴,亢进的HPA轴分泌大量CORT,损伤海马组织而加速脑老化进程。
参考文献
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Depressive effect on proliferation of vascular smooth muscle cells by tetrandrine in hypertensive rats
LI Qing-Ping(Department of Cardiovascular Pharmacology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)
LU Ze-An(Department of Cardiovascular Pharmacology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)
中图分类号:G64文献标识码:A文章编号:1003-949X(2008)-12-0077-02
“求美”是大学教育的重要功能。文化、艺术的教育是培养高品位、高素质人才的必要内容。只有学会欣赏美,才能创造美。先生在北大初建时期就十分重视在大学教育中提倡“求美”,他主张“美育与智育相辅而成,知识以外兼美感情,以图德育之完成。”活动教育作为学生自由发展的载体、经验积累的途径能够提升学校文化、丰富学校生活、增强学校活力,为学生的自由全面发展提供平台。
一、“求美”文化艺术活动教育的概念
“求美”文化艺术活动教育是指通过体验、养成、熏陶,使人文艺术知识内化为大学生的人文精神和艺术素养的教育过程。“求美”文化艺术活动教育旨在培养学生人文精神、审美能力和“求美”品格。“求美”文化艺术活动教育坚持为人民服务、为社会主义服务,坚持百家争鸣、百花齐放,坚持面向现代化、面向世界、面向未来的原则,对文化艺术活动教育内容进行了有针对性、有选择的取舍,努力做到雅俗共赏、健康向上。
“求美”文化艺术活动是大学校园文化的核心内容。大学校园文化历来被看作社会文化发展的潮头和先导,它相对于一般社会文化具有先进性和超前性,对社会文化发展负有选择与创造的责任。如今,随着校园对外开放的程度日益扩大,社会上的各种文化观念、行为准则、生产方式也开始跻身校园。多元娱乐活动和生活方式的出现,对学术、理性、审美等具有品味的校园文化冲击极大。高校面临着用高雅健康的文化艺术活动占领校园文化阵地,用积极向上的内容和形式陶冶大学生思想情操的考验。
二、“求美”文化艺术活动教育的意义
1.文化艺术活动教育有利于大学生知识结构的完善
新时期,社会需要高等学校教育培养出集科学素养、人文素养、艺术素养于一身的高素质人才。过去,高校普遍重视为大学生提供专业教育,对其他的领域有所淡化或忽视,致使大学生在知识结构的构成上,更多的是专业性和专门化的知识体系,其思考和认识的视野比较狭窄。专业知识的教育只形成了大学生知识结构的一个部分,要形成完善的知识结构就必须有相对的辅助知识作为支撑。“求美”文化艺术活动教育能有效的促进科学与人文的交融,通过科学与人文“两种文化”间的深刻对话,使他们在获得知识的基础上,形成深厚的文化底蕴,达到沟通、整合的目的,使大学生的理性与情感,科学精神与人文素养得到和谐发展,从而完善大学生的知识结构。
2.文化艺术活动有利于大学生社会性的培养
人的社会性是人在社会中生存和发展的基础和前提。人的社会性是指人在社会化的过程中具有了人类所特有的合作、理解、同情、关爱等主体意识,人具有了个体完整性。如果人缺乏了社会性,不仅仅是难以融入社会,而且容易产生远离社会的意识,一旦个体产生远离社会的意识,的偏激和偏见就可能滋生,不仅不利于社会的健康发展,而且也会影响人的健康发展。“求美”文化艺术活动,倡导提升大学生的人文素养、培养大学生的公民意识、形成大学生的社会责任感,通过人文、社会、科学知识、能力和修养的教育,培养大学生的合作精神、团队意识、集体主义、人文关怀等主体意识,使大学生认识到人的社会性对于人、社会、世界发展的意义和价值,使大学生在人与人、人与社会的冲突与融合中,学会克服缺陷,充分理解他人和社会,减少片面的看法,提升大学生的社会性。
3.文化艺术活动教育有利于大学生伦理道德的形成
“求美”文化艺术活动教育是着重于精神领域的教育,它以文化艺术的形式,富有形象性、感染性的特点,使人们在潜移默化的影响下,激起情感共鸣,从而使社会道德要求和善恶观念逐渐形成。文化艺术活动能展现美好的生活图景,深刻地反映社会生活,给人们提供区别善恶、美丑的标准,引起内心共鸣,使人们受到深刻的思想教育。长期以来,由于高等教育过分注重专业教育,使得大学生在思考人、社会、自然之间的关系方面,缺乏伦理道德观念。当今,世界性的生态保护与地球的永恒发展问题、国际化与本土文化的问题、生物科技与社会伦理问题、国际政治与民族冲突、种族冲突与宗教伦理等等,都成为当今世界人们必须思考的问题。因此,通过文化艺术活动,可以培养大学生的人文精神,提升大学生的文化品格,使他们尊重人的价值,获得超越人的生存的精神内涵,以其自主性、社会性思考人与社会、自然之间的关系处理,并以伦理学的视角思考科技发展与人、社会、自然之间的生态伦理关系,有利于培育形成大学生的伦理道德观念。
4.文化艺术活动教育有利于大学生审美情趣的培育
对美的不同观点,不仅是个体对美的评判标准,也集中体现出个体对美的感受、认知、理解和欣赏的素养,展示出个体在生活中的审美情趣。因此,对大学生的审美情趣的培育,不仅关系着大学生以何种标准去评判、感受、认知、理解和欣赏美,而且关系着大学生以怎样的审美情趣在生活中创造美。学会以高尚的审美情趣感受美、理解美、欣赏美、创造美,既是完善人生发展的一个重要方面,又是营造和创建现实生活及追求未来生活的内在机制和动力。大学生已进入青年阶段,不仅关注自己和他人的仪表美、语言美、行为美,而且以更为细腻的情感和独立的思考来感受、认知、评鉴生活中各种人和事物的更广泛、更深刻的美,并以美的标准创造美。所以,通过文化艺术活动教育,可以提高大学生的审美情趣,让大学生对美好事物的感受、理解和创造从简单的、表面的印象提升为对丰富、深刻的美好意境的欣赏,升华到精神美的境界,激发大学生理解美、欣赏美和创造美的意识和激情。
三、“求美”文化艺术活动教育内容确定的原则
“求美”文化艺术活动教育的内容体系是大学生文化艺术素质教育的基础环节,是实现教育目标的重要保证,是大学生“求美”文化艺术活动教育有效实施的根本条件。其教育内容的确定既要符合素质教育的目的又要满足学生的需求,既要区别专业教育、学科教育又要与专业教育、学科教育相衔接,因此要科学、合理的进行选择、整合、优化,这就必须遵循一定的客观原则。
1.导向性原则
随着经济的发展、分工的细化、文明的进步,现代社会将越来越重视人才的综合品性,特别是人才的团结合作意识、人文素养、心智模式。因此,构建“求美”文化艺术活动教育内容体系,应该关注大学生品德、团队意识、创新精神、人文修养等特性的培育。让大学生获得一个合格建设者所应该具备的公民意识、社会责任意识,让社会逐步理解大学生这些素质的提升对于社会发展的意义和价值。
2.基础性原则
大学生“求美”文化艺术活动教育不是专业教育的附属,它主要是为大学生的全面发展提供通识性、广博性的基础性知识和能力。大学生“求美”文化艺术活动教育不是对学生进行专业知识和专业能力的教育,而是主要进行基本认识、基本素养、基本技能的训练,是从大学生全面发展的角度构建内容体系。通常我们将人的进一步发展的基础归纳为三个方面,即知识、能力、修养。所谓“知识”,不仅是指专业知识,还包括人文历史、文明道德、科学技术、社会艺术等一般性的知识;所谓“能力”,也不仅仅是指专业的技能技巧,还包括思维理解能力、实践操作能力、自主学习能力等等;而“修养”更是一个人发展的基石,表现为健康的个性心理品质、积极的团队合作意识、文明的社会道德行为、良好的科学素养等。
3.民族性原则
在大学生“求美”文化艺术活动教育内容选择的过程中,不仅要重视学生基础性知识和能力的培养,还应特别重视中国传统文化的特色,要求大学生熟悉中国文化的精髓,知晓中国文化的历史渊源。这一原则的提出主要是针对我国高校大学生缺乏对我国传统文化全面的认识和理解,特别是我国传统文化中的人文教育思想,儒家的“仁”、“孝”、“信”的理念,对待人生和社会的积极态度等思想学说,这些内容对当代大学生可能比较陌生。所以,坚持民族性原则,合理安排教育内容,加强对我国民族文化及思想方面的教育,不仅有利于大学生认识和理解我国民族文化的博大精深,而且能够培养大学生的民族精神。
4.计划性原则
大学生“求美”文化艺术活动教育内容体系构建如果不合理,就容易造成与专业教育和学科课程内容的交叉,从而冲击专业教育。要实现把大学生“求美”文化艺术活动教育内容融入学校整体教育内容体系,既达成素质教育的目标,又不至于冲击专业教育。因此,必须有目的、有计划地对内容体系进行精心、合理的设计,避免教育内容的重叠,使大学生“求美”文化艺术活动教育内容体系尽量系统化、简洁化。
5.整合性原则
大学生“求美”文化艺术活动教育的内容不是相对独立的体系和结构,而是众多相关学科基础文化知识、技术能力经验的综合,各个方面密切相关、相互作用、相互制约,共同构成一个开放的适合学生各方面需要的内容整体。在内容选择上不是“杂、乱、散”碎片内容的堆砌,而应遵循教育规律,遵循大学生发展的需求,围绕人的综合素质的提高,整合大学生的校园生活和社会生活,并将知识性学习和体验养成性的教育有机的结合起来,做到由浅入深、重点突出、整体协调,从而提升学生的主体意识,学会处理人与人、人与社会之间的关系,充分理解他人和社会,培育大学生的社会责任感,倡导集体主义、人文关怀等时代精神。
6.体验与养成性原则
大学生“求美”文化艺术活动教育不同于其他教育,不能单靠知识传授和技能培养来完成,而是要通过教育、体验、养成、熏陶,从而促使大学生把学到的知识和能力内化为自身的素质和修养,塑造他们的科学与人文精神。这就需要在内容的构建上强化体验性和养成性教育,把体验性、养成性的活动和方法作为教育内容,通过规范的引导、环境的熏陶、身体力行的实践,帮助大学生形成文明的举止和良好的人格。
四、“求美”文化艺术活动教育的内容
1.哲学知识普及活动
根据的观点,“任何真正的哲学都是自己时代精神的精华”。对青年大学生进行哲学教育,增强其理论思辨能力,有助于他们高屋建瓴,把握整体,突破各具体学科的局限,超越人文与科学认识的界限。把哲学教育作为“求美”文化艺术活动教育的主要内容,有助于引导学生通过哲学思辨,去探究超越于现实功利的人生意义、理想、信仰与终极关怀,构建正确的世界观、人生观和价值体系。开设定期的论坛、讲座是进行哲学知识普及的最好形式。
2.传统文化教育活动
我国的传统文化是在中国社会长期发展过程中逐渐形成并支配着大多数人的具有积极意义的价值观念、道德标准和行为规范等意识形态因素,是一个蕴含着丰富内容的综合体。所以,加强对我国文化及思想方面的知识教育,不仅有利于大学生认识和理解我国传统文化的博大精深,而且能让学生重塑民族人文精神,树立奋进图强的民族精神,激发学生的爱国主义情感与高度的民族责任感。如开展诗词吟诵大赛、诵读经典活动、传统纪念日的纪念活动、典型历史人物的学习活动等。
3.世界文化教育活动
随着我国改革开放的不断深入,西方多元文化的价值观、不同主张的自由化思想观念等对我国高校大学生的冲击很大,极大地影响着大学生对我国传统文化和社会发展的立场和态度。通过对世界文化的教育,使大学生对世界文化及思想有个系统、全面的认识,可以让学生了解和认识世界各国人民的历史,掌握历史发展的脉搏,让学生在错综复杂的国际关系中保持清醒的头脑。可以开设国际文化交流论坛,邀请专家进行国际文化讲座,进行国际文化交流,开展西方经典电影、戏剧、文学赏析活动等。
4.人与自然、社会和谐共处教育活动
随着科学技术的发展,人与自然之间的关系出现了改变,人类的活动影响了自然的自我发展,并严重危及了人类自身的生存和发展。因此,应该让大学生了解人与自然和谐共处的意义和价值,思考人类社会可持续发展的问题,加强大学生的环境意识。另外,让大学生确立起“人”是社会经济发展的最终目的这一思想观念,使大学生学会与人相处、与人交流,从而实现人与社会的和谐发展。可以通过开展“保护母亲河”主题活动、第三只眼看社会主题摄影展、“人与自然”主题征文等活动进行这一内容的教育。
5.文艺鉴赏教育活动
文学、艺术作品包含着人们对不同时期人的生存状况的描写和反映,同时也体现着人们对人生问题的深刻思考,不仅能引发大学生的思考,而且能够升华大学生的人文关怀、润泽大学生的心灵、促进大学生人的本性的觉醒和提升。通过引导大学生进行文艺作品鉴赏,能够让他们领悟美的真谛,培养大学生欣赏美、体验美、鉴赏美和创造美的意识,进一步提高大学生的艺术修养和审美能力,使他们对文学、艺术作品有一定的的鉴赏和评论能力,能借助文学、美术、音乐来表达自己的感情,能将追求完美的意识渗透到生活和学习中去,升华大学生对生活美、艺术美的追求,培养其高雅的审美情趣。可以通过戏剧、歌舞、器乐、文学、传统艺术表演等各种形式培养大学生的审美能力。
参考文献:
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研究表明CXC趋化因子配体16(CXC chemokine ligand 16,CXCL16)作为一种新的趋化因子配体,能够促进动脉平滑肌的增殖〔1〕。罗格列酮(RSG)作为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的激动剂抑制血管平滑肌细胞的增殖〔2〕。本研究通过观察RSG对CXCL16诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响,验证其在血管平滑肌增殖中的作用,并进一步探讨其机制。
1 材料与方法
1.1 材料 成年大鼠,雌雄不限(由吉林大学实验动物中心提供)。RPMI1640培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),重组鼠CXCL16(美国R&D systems公司),LY294002(美国BioVision公司),吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)(美国Sigma公司),兔抗大鼠α平滑肌肌动蛋白(αSMA)多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司),兔抗大鼠CXCL16多克隆抗体(美国Santa Cruz公司),二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。RTPCR试剂盒(立陶宛MBI Fermentas公司)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 大鼠髂主动脉平滑肌细胞的分离与培养 经水合氯醛麻醉后,颈动脉放血处死动物。在无菌操作条件下迅速取出全部髂段主动脉,立即置于冷DHank′s液中,用眼科镊仔细剥离近外膜侧1/3处含成纤维细胞多的外膜后,放在无菌的玻璃纸上固定后,纵形剖开血管,用锋利刀片轻轻刮除多余脂肪及内膜,DHank′s液洗涤,放入培养皿中,用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm大小,将小组织块均匀铺于培养瓶壁,置于CO2孵箱。待组织块贴壁牢固后,再加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基继续培养。
1.2.2 平滑肌细胞的传代及鉴定 待细胞生长至瓶底的80%以上后,吸弃培养液,无菌磷酸盐缓冲液(PBS)充分清洗3次。加入0.25%胰蛋白酶少许,室温下将培养瓶置于倒置显微镜下观察。待细胞回缩、细胞间隙增大后,立即用含10%胎牛血清的培养液终止消化,吸除消化液,加PBS液,轻轻转动培养瓶,除去残余消化液。加入培养液,用吸管轻轻反复吹打瓶壁细胞,使之脱落瓶壁形成细胞悬液,分装后继续培养。取其4~6代细胞用兔抗大鼠αSMA多克隆抗体对其进行鉴定。
1.2.3 用细胞计数法检测CXCL16对平滑肌细胞增殖的影响 以1×104/ml个细胞接种于24孔培养板,用浓度为50 ng/ml的CXCL16分别作用于平滑肌细胞1、2、4及8 d,用细胞计数法测定平滑肌细胞的增殖情况。仅含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液作为阴性对照;含20 ng/ml血小板生长因子(PDGF)BB的上述培养液作为阳性对照。
1.2.4 药物处理 取1.2.2传代细胞,分为5组,用不同药物进行处理。空白对照组(1组):RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清)培养细胞。CXCL16组:在1组培养液基础上加入终浓度为50 ng/ml CXCL16。PI3K/Akt特异性抑制剂组(CXCL16+LY294002):在1组培养液基础上加入终浓度为20 μmol/L LY294002,作用1 h后,再加入终浓度为50 ng/ml CXCL16。核转录因子(NFκB)特异性抑制剂组(CXCL16+PDTC):在1组培养液基础上加入终浓度为100 μmol/L PDTC,作用1 h后,再加入终浓度为50 ng/ml CXCL16。RSG组(CXCL16+RSG):在1组培养液基础上加入终浓度为20 μmol/L RSG,作用1 h后,再加入终浓度为50 ng/ml CXCL16。每组至少重复3次。
1.2.5 噻唑蓝(MTT)法检测血管平滑肌细胞的增殖 将细胞消化后,制备单细胞悬液。以1×104个/孔接种至96孔板,培养24 h后弃去上清,加入条件培养基150 μl,每组设8个复孔。培养4 d后,吸弃培养液,每孔加入20 μl MTT,37℃继续孵育4 h。吸弃培养液,每孔加入150 μl DMSO终止反应。振荡混匀,置酶标仪上测定490 nm处的吸光度(A490)。
1.3 统计学处理 采用SPSS11.5软件,所有数据以x±s表示。组间比较采用方差分析或秩和检验。
2 结 果
2.1 血管平滑肌细胞的鉴定 倒置显微镜下观察,细胞呈长梭形生长,在细胞生长融合部分可见明显的“峰谷”形态。用平滑肌细胞特异性抗体αSMA进行免疫细胞化学鉴定,光镜下观察可见细胞胞质内棕黄色颗粒,证明培养的细胞为血管平滑肌细胞。见图1。
图1 大鼠平滑肌细胞免疫组化鉴定(DAB,×400)
2.2 CXCL16对平滑肌细胞增殖的影响 自CXCL16作用的第1天起,CXCL16组平滑肌细胞增殖能力明显高于阴性对照组(P
2.3 RSG抑制平滑肌细胞的增殖 以50 ng/ml CXCL16作用于平滑肌细胞4 d后,采用MTT法测定细胞的增殖能力。结果显示,CXCL16组平滑肌细胞增殖能力较对照组明显提高(P
3 讨 论
人们发现动脉粥样硬化(AS)不只是简单的脂质堆积,炎症在其发生、发展以及最终斑块破裂的整个病理过程中显示出至关重要的作用〔3〕。因此,许多细胞因子引起了人们的关注,CXCL16是一种新发现的趋化因子配体。已发现CXCL16可促进平滑肌细胞、内皮细胞增殖,还能增加细胞与细胞的黏附,也有研究发现AS斑块处巨噬细胞和平滑肌细胞CXCL16表达增高,因此可推断CXCL16在多个环节参与AS的发生、发展,同时也提示它可能在损伤修复以及炎症反应中起着重要的作用。本研究以离体血管平滑肌细胞为原料,发现CXCL16组平滑肌细胞增殖能力明显高于阴性对照组,这种促进作用的峰值出现在第4天,此结果验证了它对血管平滑肌细胞的增殖作用,同时也证实尽管炎症反应在上调CXCL16表达中起着重要的作用,但最终这些炎症反应引起的细胞增殖可能还是由CXCL16及其受体来实现的。这就为纠正CXCL16表达,进而治疗AS等损伤修复型疾病提供了一种新的可能。
RSG除了作为胰岛素的增效剂在临床上广泛应用外,近年也有很多用它治疗AS等其他疾病的尝试〔4~6〕。RSG可提高内皮系统对各种损伤的修复能力,也提示了胰岛素增敏剂对血管内皮细胞很好的保护作用,对维持血管内皮系统功能至关重要〔7〕。本研究通过MTT法验证RSG对CXCL16诱导的血管平滑肌细胞增殖有明显的抑制作用。RSG等噻唑烷二酮类药物改善血管内皮功能、抗AS的机制尚未彻底清楚可能为:① 通过增加胰岛素的敏感性,增加eNOS的表达,促进内皮细胞释放NO,抑制ET1的释放等间接的因素而改善内皮功能〔8〕;②最近发现PPARγ也存在于AS发展的关键细胞如血管平滑肌细胞、巨噬泡沫细胞和血管内皮细胞,提示噻唑烷二酮类药物可直接作用于PPARγ影响AS的进程〔9〕;③ 抑制炎性介质释放,发挥抗炎、抗氧化应激作用,减轻AS发展过程〔10〕。同时,发挥降糖、降脂作用,调节血管内皮功能,从改善代谢方面发挥保护作用。本实验为RSG抗血管平滑肌增殖提供依据,同时也为开发罗格列酮临床上新的使用途径提供了理论基础,噻唑烷二酮类药物抗AS的具体机制还需更进一步研究。
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关键词: 反义寡核苷酸;血管平滑肌细胞;再狭窄;血小板衍化生长因子;受体;细胞核增殖抗原
摘 要:目的 研究血小板衍化生长因子β受体(PDGFR-β)反义寡核苷酸(AODN)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响. 方法 建立大鼠血管平滑肌细胞体外增殖模型.将细胞分为反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组和空白对照组,其中反义组按浓度又分为1,2.5,5,10和15μmol L-1 5小组.在加药后24,48和72h以流式细胞仪测定细胞周期,免疫细胞化学染色分析细胞核增殖抗原的表达,MTT(四唑盐)比色法测定细胞增殖活力. 结果 10μmol L-1 PDGFR-βAODN干预VSMC48h后,处于DNA合成前期(G0 /G1 )细胞数分数(0.70)高于空白对照组(0.07,P
Keywords:antisense oligonucleotide;vascular smooth muscle cell;restenosis;platelet derived growth factor;receptor;proliferating cell nuclear antigen
Abstract:AIM To study the effect of PDGFR-βAODN on proliferation of cultured rat aortic vascular smooth muscle cells(VSMC).METHODS Cultured rat aortic VSMC mod-el was established in vitro.The cells were pided into antis-ese oligonucleotide(AODN)group,sense oligonucleotide(SODN)group,scrambled oligonucleotide(CODN)group and control group.The cells in AODN group were subpided into five small groups by concentration of1,2.5,5,10,15μmol L-1 .MTT assay,flow cytometry,immunohis-tochemistry for proliferating cell nuclear antigene(PCNA)were used to determine the effects of PDGFR-βAODN on proliferation of VSMC.RESULTS The percentage of quies-cent cells(G0 /G1 )of AODN group at48h(0.70)were much higher than that of control group(0.07),P
0 引言
经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)和冠状动脉旁路移植术(CABG)是治疗冠心病的有效手段,但30%~50%术后再狭窄严重影响手术疗效[1,2] .研究证明再狭窄的实质就是血管中层平滑肌细胞向内膜下迁移和增生
[3] .血小板衍化生长因子及其β受体(PDGFR-β)在血管平滑肌细胞(VSMC)的迁移增生过程中起重要作用
[4] .我们拟探讨在大鼠体外VSMC增殖模型中,PDGFR-β反义寡核苷酸(AODN)对VSMC增殖的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠清洁级,4wk龄,雌雄不限,体质量(250±20)g,4~8wk龄,由第四军医大学实验动物中心提供;抗大鼠PCNA mAb、混合胶原酶、胰蛋白酶、MTT购于Sigma公司;96孔培养板、6孔培养板购于Costar公司;PDGFR-βAODN链(18bp)5’TAT CAC TCC TGG AAG CCC3’,正义寡核苷酸链(SODN)5’GGG CTT CCA GGA GTG ATA3’,无关寡核苷酸链(CODN)5’GTG ATA GTA TGC CGA GCA3’,由加拿大上海Sagon公司合成并进行全硫代磷酸化修饰和电泳鉴定;SABC试剂盒购于武汉博士德生物工程公司;胎牛血清购于浙江金华犊牛研究所;流式细胞仪(EFICS ELITE法国);酶联免疫检测仪(DG5031,华东电子仪器厂);SD大鼠颈椎脱臼法处死后,采用胶原酶法分离取得VSMC进行原代培养和传代培养,经α-SMactin免疫细胞化学染色鉴定确为VSMC、纯度>95%,采用5~10代细胞为实验对象.
1.2 方法
1.2.1 VSMC细胞增殖活力的测定 取生长融合期细胞制成1×104 L-1 密度的单细胞悬液接种于96孔板,待细胞完全贴壁伸展后,无血清DMEM培养液驯化24h.采取不同的加药方案:①单加不同浓度的反义寡核苷酸;②加入5.0μmol L-1 反义、正义、无义寡核苷酸;③空白组加等量培养液,设调零孔.每24h各取8孔,每孔内加入MTT20μL,37℃继续孵育4h后小心吸去培养液.每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL,震荡器震荡10min,用酶联免疫检测仪(波长490nm)测定各孔的吸光度值[5] .细胞增殖抑制百分率=(1-试验组A值)/对照组A值均数×100%.
1.2.2 PCNA免疫细胞化学染色 将5×105 L-1 密度细胞悬液,接种于已置盖玻片的6孔培养板中,待细胞完全贴壁伸展后,无血清DMEM培养液驯化24h后,加入含不同干预因素(同1.2.1)的200mL L-1 胎牛血清DMEM,每24h各取5孔,取出盖玻片,按SABC试剂盒说明进行其余步骤操作,最后DAB显色,常规系列脱水、透明.镜下观察.PCNA染色阳性标准:细胞核内出现棕黄色颗粒.随机计数5张盖玻片中5个以上高倍镜视野500个细胞,计算平均每100个细胞中阳性百分率,根据染色强度和范围分为:阴性(-):阳性细胞50%.
1.2.3 流式细胞仪测定细胞周期 将细胞制成2×105 L-1 密度的单细胞悬液,接种培养瓶,48h后弃去 培养液,无血清驯化24h,细胞周期同步化后,分别加入5.0μmol L-1 反义、无义寡核苷酸,继续培养,48h后停止培养,0.01mol L-1 PBS(pH7.4)洗2次,2.5g L-1 胰酶消化后离心,以700mL L-1 的冷乙醇制成1×10
6 L-1 密度单细胞悬液,30min后,PI染色,流式细胞仪检测.
统计学处理:实验数据用x ±s表示,组间进行t检验,P
2 结果
2.1 寡核苷酸对VSMC增殖活力的影响 相同浓度(10μmol L-1 )各种寡核苷酸对血管平滑肌作用24h后,各加药组与空白对照组相比MTT A值无明显差异(P>0.05),各加药组之间也无明显差异(P>0.05);在加药后48h反义组与空白组之间有显著性差异(P0.05),5μmol L-1 以上浓度的PDGFR-βAODN对细胞有明显增殖抑制作用,表明PDGFR-βAODN增殖抑制作用有明显的浓度依赖效应.
表1 寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的影响 略
2.2 PDGFRβAODN对细胞周期的影响 与空白对照组相比10μmol L-1 AODN作用于VSMC24h后细胞G1 期(DNA合成前期)比数分数达到0.70,而空白对照组G1 期细胞只占0.50明显低于AODN组(P
2.3 PCNA免疫细胞化学染色 空白对照组PCNA染色呈强阳性(Fig1A);5μmol L-1 PDGFR-βAODN作用于VSMC48h后细胞PCNA染色呈阳性;10μmol L-1 以上AODN作用于VSMC48h后细胞PCNA染色呈阴性(Fig1B),阳性率与对照组比较有明显差异(P
图1 PCNA染色 略
表2 不同寡核苷酸对血管平滑肌细胞PCNA表达的影响 略
表3 反义寡核苷酸浓度对血管平滑肌细胞PCNA表达的影响 略
3 讨论
PDGF对VSMC是一种强烈的促增殖剂和趋化剂,并且PDGF对VSMC的作用有一定的组织特异性[6] .当大量PDGF和β型受体结合后通过络氨酸激酶启动细胞的增殖信号,最终导致VSMC大量增生和再狭窄的发生[7,8] .PDGF的主要作用是使细胞从非分裂状态的G1 期进入分裂周期,起着一种“获能因子”(competence factor)的作用,其他生长因子如成纤维细胞生长因子(FGF)可以促进细胞从G1 期进入DNA合成期[9] .反义寡核苷酸可以通过其特异的碱基序列与目的基因相结合阻止目的基因的表达[10] .因此PDGFR-β反义寡核苷酸可以阻止VSMC的PDGFR-β蛋白的表达从而阻断其与PDGF的结合,使细胞停留于G1 期,最终抑制VSMC的增殖.另外我们在实验中发现PDGFR-βAODN作用于VSMC24h对VSMC无明显增殖抑制作用,这与AODN虽被细胞摄取,但尚未能与目的基因达到充分结合等原因有关;过去的研究证明PCNA是DNA复制和细胞分裂过程中DNA多聚酶最重要的辅助因子.PCNA位于细胞核内,它的表达量与VSMC的增殖活力呈正相关[11] .因此我们在实验中以PCNA的表达强度侧面反映VSMC的增殖活力,结果间接证明了PDGFR-βAODN对VSMC增殖抑制作用.另外也有少数人认为寡核苷酸的作用无需任何序列特异性,而是与各种生长因子或膜蛋白相结合,抑制细胞的迁移、增殖.这与目前大多数同仁的观点不符,与本实验的研究结果也不相符.我们发现正义寡核苷酸和错义寡核苷酸对VSMC的增殖均无明显抑制作用.这说明寡核苷酸对细胞的影响有严格的序列特异性.
PDGFR-βAODN作为基因工程和分子生物学的产物对体外培养VSMC的增殖可以产生很大程度的抑制,另外因为该反义寡核苷酸对于VSMC具有一定的组织特异性,所以PDGFR-βAODN有望能在体内成功抑制血管损伤后VSMC的异常增生和再狭窄的形成.
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【关键词】 松果体; 褪黑素;替代治疗;学习记忆;室管膜下区;神经干细胞;增殖;大鼠
【Abstract】 Objective To investigate the effects of melatonin replacement therapy on the learning and memory as well as on the proliferation of neural stem cells in the subventricular zone(SVZ) of the lateral ventricle in pinealectomized adult rats.Methods Thirty male Sprague-Dawely rats were randomly pided into three groups with ten rats per group: sham-operated,pinealectomized and melatonin-replacement therapy. After two days of operations,the rats in melatonin-replacement therapy group received daily peritoneal injection of melatonin( 200μg/kg body weight,dissolved in 5ml of 5% ethanol-NaCl solution)for twenty one consecutive days; while the rats in sham-operated and pinealectomized groups were daily given the equal volume of vehicle under the same conditions. After sixteen days of operations,the rat performences in Morris water maze were detected for five consecutive days. Then the number of proliferating cell nuclear antigen immunoreactive (PCNA-IR) cell nuclei in the SVZ was counted.Results Navigation tests showed that the escape latency for finding the platform during training trials of pinealectomized rats was significantly longer than that of sham-operated or melatonin-replacement rats (P<0.01). Probe tests revealed that pinealeetomized rats had much worse knowledge of the platform’s prcise location than sham-operated or melatonin-replacement rats did (P<0.01). Similarly,the mumber of PCNA-IR cell nuclei in the SVZ of pinealectomized rats was significantly lower than that in sham-operated or melatonin-replacement rats (P<0.01). However,melatonin replacement therapy reversed the above parameters(P<0.01),which nearly reached the levels of sham-operated rats(P>0.05).Conclusion The data for the first time demonstrate that pinealectomy reduces the level of endogenous melatonin,and impairs the learming and memory processes as well as the proliferation of neural stem cells in the SVZ,whereas exogenous melatonin replacement therapy can reverse these changes,indicating that melatonin plays an important role in maitaining the normal learning and memory processes as well as in augmenting the neurogenesis in SVZ; and that melatonin may promote the neurogenesis in SVZ via activation of melatonin receptors in both neural stem cells and astrocytes,thereby enhancing olfactary memory.
哺乳动物侧脑室室管膜下区(subventricular zone ,SVZ)是脑内终生存在神经发生(neurogenesis)的一个主要部位,由此产生的神经干细胞通过有丝分裂形成祖细胞(progenitor cell),后者迁移到嗅球,分化成新的中间神经元,代替衰老或死亡的神经细胞,使局部神经环路的结构得到不断更新,从而发挥正常的嗅觉及嗅觉记忆功能[1]。褪黑素是主要由松果体合成和分泌的一种神经内分泌激素,已证实其不仅具有促进胚胎个体发育及体外培养神经干细胞增殖的功能[2,3],而且还可提高学习记忆能力[4]。然而,迄今仍匮乏有关褪黑素对成年在体SVZ神经发生及学习记忆影响的报道。为此,笔者最近进行了研究并初步观察到,松果体切除对成年大鼠SVZ神经发生及学习记忆均产生类似的负性效应[5]。为进一步揭示褪黑素、神经干细胞及学习记忆三者之间的内在联系,本研究通过观察褪黑素替代治疗对上述指标的影响模式,为阐明学习记忆的神经内分泌机制提供新的资料。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 小鼠抗人PCNA单克隆抗体为DAKO公司产品;生物素结合IgG、链霉菌抗生物素-过氧化酶(SP)及二氨基联苯胺(DAB)染色试剂盒均为福州迈新公司产品;褪黑素为Sigma公司产品。
1.2 动物与分组 选用清洁级健康雄性Sprague-Dawely大鼠30只,8~10周龄,体重150~180g,由广西医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为以下3组,每组10只:假手术、去松果体及褪黑素替代治疗组。
1.3 动物模型的建立 参照袁群芳等的方法[4],进行松果体切除术,假手术除不切除松果体外,其余步骤与上述相同。所有动物在自然光暗周期的环境中分组饲养,自由饮水、进食。
1.4 替代治疗方法 术后第2天开始进行相应的干预,褪黑素替代治疗组的每只大鼠按200μg/kg 剂量将褪黑素溶于0.5ml的5%(V/V)乙醇-生理盐水中,每天在固定时间(18:00 pm)腹腔注射1次,连续给药21天。在相同条件下,每天给予假手术组和去松果体组的每只大鼠腹腔注射0.5ml的5%乙醇-生理盐水,连续注射21天。
1.5 学习记忆能力的测定
1.5.1 定位航行实验 于术后16天开始用Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所研制,型号:DMS-2)测试,历时4.5天,每天分上、下午2个时段,每只大鼠在每个时段测试4次,记录大鼠每次自入水直至找到并爬上平台所需的时间,即逃避潜伏期,如60s找不到平台即记录为60s,以此作为判断大鼠学习能力的指标。
1.5.2 空间探索实验 在测试的第5天下午撤走平台,将大鼠放入水中,通过电脑测试系统记录大鼠在2min内的游泳轨迹,计算出大鼠在原平台象限的游泳距离占总游泳距离的百分比,以此作为判断大鼠记忆能力的指标。
1.6 组织切片制备 各组大鼠在完成测试学习记忆能力后,1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉,经心脏灌注100ml 生理盐水,继之灌注500ml的4%多聚甲醛固定液(0.1mol/L PB液配制,pH 7.4,4℃)。除去颅盖骨,将头部固定于脑立体定位仪上,参照大鼠脑立体定位图谱[6],在前囟前1.6mm至前囟后4.8mm的范围内切取脑组织块,置于相同的固定液后固定3h(4℃),转至30%蔗糖溶液(0.01mol/L PBS配制,pH 7.4,4℃),待组织块下沉后行冠状连续冰冻切片,片厚40μm,隔3取1,收集于0.01mol/L PBS中,待反应。
1.7 免疫组化反应 采用SP法检测SVZ的增殖细胞核抗原(proliferating cell nucleus antigen,PCNA)的表达,主要步骤如下:切片入3%(V/V)H2O2溶液室温15min,消除内源性过氧化物酶的活性;入0.1%(V/V)Triton X-100溶液(0.01 mol/L PBS配,pH 7.4)室温孵育1h;正常羊血清室温封闭抗原20min;小鼠抗人PCNA单克隆抗体(1:100)室温孵育22h;生物素结合IgG室温孵育2h;SP室温孵育2h;0.05%DAB(含0.01%(V/V)H2O2)室温显色约30s。在上述过程中,完成每一步骤后均用0.01mol/L PBS(pH 7.4)漂洗15min,然后再进行下一步骤。常规脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照实验除用羊血清代一抗外,其余步骤与上述相同。
1.8 细胞计数 每只动物选取3张切片(前囟前0.8mm、1.0mm、1.2mm)作为观察对象[6],光镜下(40×10)计数左侧侧脑室SVZ的背侧、外侧及内侧3个视野的PCNA阳性细胞数。
1.9 数据统计分析 采用SPSS 10.0统计软件中的单因素方差分析对原始数据进行统计处理,用最小差异显著性检验(LST)及Games-Howell检验对数据进行两两比较,以双侧α=0.05作为显著性检验水准,最后得出的数据以x±s表示。
2 结果
2.1 Morris水迷宫测试结果 各组大鼠的逃避潜伏期及在原平台象限游泳距离的百分比分别见表1及图1。
从表1可见,除测试的第1时段外,去松果体组大鼠在其余测试时段的逃避潜伏期均比褪黑素替代治疗或假手术组大鼠明显延长,组间的差异有非常显著性(P<0.01),而褪黑素替代治疗组大鼠与假手术组大鼠的逃避潜伏期较为接近,组间差异无显著性(P>0.05)。在整个测试中,去松果体、褪黑素替代治疗及假手术组大鼠9个时段的平均逃避潜伏期分别为33.89、19.73及18.28s,其中去松果体组的平均逃避潜伏期分别比褪黑素替代治疗组和假手术组明显增加了71.8%和85.4%,组间差异有非常显著性(P<0.01),但褪黑素替代治疗组与假手术组之间差异仍然无显著性(P>0.05)。
从图1可见,去松果体、褪黑素替代治疗及假手术组大鼠在原平台象限游泳距离的百分比分别为18.7%、40.3%及45.8%;去松果体组大鼠分别比褪黑素替代治疗组和假手术组大鼠明显下降了53.6%和59.2%,组间差异有非常显著性(P<0.01),而褪黑素替代治疗组与假手术组大鼠之间差异无显著性(P>0.05)。
2.2 PCNA阳性细胞的变化 SVZ的PCNA免疫反应产物定位于细胞核,呈棕黄色,阳性细胞核为圆形、椭圆形或梭形,各组大鼠SVZ的PCNA阳性细胞核形态均无明显差异。此外,用羊血清替代—抗的反应结果也为阴性。对各组大鼠左侧侧脑室SVZ的PCNA阳性细胞核计数的结果见表2。
由表2可见,去松果体组大鼠SVZ的PCNA阳性细胞核数分别比褪黑素替代治疗组及假手术组大鼠明显下降了37.1%和38.8%,组间差异有非常显著性(P<0.01),而褪黑素替代治疗组与假手术组之间则差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
神经干细胞是一种具有高度增殖能力的原始细胞,为了解这类细胞的增殖状态,常通过观察其细胞周期中的标志物变化来加以断判之。PCNA既是属于种系发生中高度保守的DNA多聚酶δ辅助蛋白,又是参加细胞DNA合成的一个不可或缺的蛋白因子[7]。PCNA定位于细胞核,在神经干细胞增殖的DNA合成期中表达,且其表达水平与DNA合成的活跃程度呈正比[8],故PCNA是研究神经发生动力学的一个重要指标。由于PCNA具有以上特点,故本研究用其来观测神经干细胞的增殖变化。
既往研究表明,在体外培养的新生大鼠SVZ神经干细胞经表皮生长因子刺激后,再加入褪黑素可明显提高神经干细胞的增殖率[2],而且褪黑素还可加速个体胚胎生长和发育的进程[3],说明褪黑素对细胞发生及胚胎形成均产生明显的正性效应。由此可推测,褪黑素有可能对成年在体SVZ神经干细胞的增殖施加某种影响。为探讨这一问题,笔者最近做了相关研究,结果初步显示,通过切除松果体消除内源性褪黑素的主要来源,可明显降低成年大鼠SVZ的PCNA阳性细胞核数(P<0.01)[5];本研究结果则显示,褪黑素替代治疗可使因去松果体下降的PCNA阳性细胞核数明显升高到正常水平(P<0.01)。因此,以上结果与其他作者的基本一致[2,3],也充分证实了笔者的推测,即褪黑素对成年在体SVZ神经干细胞具有促增殖作用,而且此作用呈现出对部位、细胞种类及发育阶段的非依赖性。其作用机制可能与两方面有关:(1)褪黑素直接作用于神经干细胞上的相应受体[3],使PCNA表达上调,促进更多的细胞进入DNA合成期,为产生更多的子细胞提供了合成代谢的物质基础;(2)褪黑素作用于局部星形胶质细胞上的相应受体[9],促进星形胶质细胞与神经干细胞相互作用并合成及释放多种细胞生长因子,后者可保护子细胞完成迁移抵达终点以及分化成局部中间神经元[10],这对于完成使局部神经环路的结构得到不断更新转归和整合以及维持功能的可塑性均有重要的生物学意义。
袁群芳等报道[4],松果体源性褪黑素具有提高大鼠在Morris水迷宫的学习记忆能力。笔者前期的研究[5]、本研究亦表明,去松果体可使大鼠在Morris水迷宫的学习记忆能力下降(P<0.01),褪黑素替代治疗则可提高去松果体大鼠的学习记忆能力(P<0.01),这与上述作者的相一致。此外,本实验结果还首次显示,在去松体或褪黑素替代治疗状态下,学习记忆的变化与PCNA阳性细胞核数的变化之间存在着惊人的相似之处,故两者的变化趋势呈现出平行关系。提示褪黑素很有可能通过前述的机制来提高SVZ的神经发生,使神经干细胞产生更多的祖细胞,经吻侧迁移途径(rostral migratory stream)源源不断地迁移到嗅球,最终分化成颗粒细胞和小球周细胞,从而提高嗅觉记忆功能[11];也有可能通过促进基底前脑胆碱能系统的功能来提高学习记忆能力[4]。至于是否另有提高学习记忆能力的其他机制,有待于进一步研究澄清。
临床研究表明,嗅觉障碍是在老年性痴呆早期首发的主要症状之一,并随病程进展而加重[12]。此外,老年性痴呆患者脑脊液的褪黑素水平显著下降,褪黑素分泌的节律性也明显紊乱[13]。这些结果提示,在老年性痴呆的发病中,有可能由于褪黑素的合成和分泌减退以及节律异常,导致SVZ神经干细胞的增殖严重受损,使嗅球需要更新的局部中间神经元得不到及时补充,进而引发嗅觉及嗅觉记忆功能障碍。因此,除了可用褪黑素调动原位SVZ神经干细胞来防治老年性痴呆外,还可在用神经干细胞移植或基因治疗该病中宜添加褪黑素,使得移植的神细干细胞能有效分裂、整合到靶组织,目的基因也能长期表达产物,从而在该病的神经结构重建及功能恢复方面有可能获得意想不到的效果。
1 Taupin P. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system: functionality and potential clinical interest. Med Sci Monit,2005,11(7):247-252.
2 段发亮,陈俊抛.褪黑素对EGF作用后神经干细胞增殖的影响.实用医学杂志,2002,18(7):688-690.
3 Ishizuka B,Kuribayashi Y,Murai T,et al. The effects of melatonin on in vitro fertilization and embryo development in mice. J Pineal Res ,2000,28(1):48-51.
4 袁群芳,何宏发,田荣波. 摘除松果体对大鼠学习记忆及基底前脑碱胆能系统的影响.解剖学研究,2003,25(1):30-32.
5 郭灵,林丹,曾庆堂,等. 去松果体后成年大鼠学习记忆及侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖的变化.解剖学研究,2005,27(4):252-256.
6 包新民,舒斯云. 大鼠立体定位图谱.北京:人民卫生出版社,1999.
7 Fukuda K,Morioka H,Imajou S,et al. Structure -function relationship of eukaryotic DNA replication factor,proliferating cell nuclear antigen. J Biol Chem,1995,270(38):22527-22534.
8 Ion H ,Chiba T. Expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)in the adult and developing mouse nervous system. Brain Res Mol Brain Res,2000,78(1-2): 163-174.
9 Niles LP,Armstring KJ,Rincon Castro LM,et al. Nerual stem cells express melatonin receptors and neurotrophic factors :colocalization of the MT1 receptor with neuronal and glial markers.BMC Neurosci,2004,5(14):41-49.
10 Lim DL,Alvarez-Buylla A. Interation between astrocytes and adult subventricular zone precursors stimulates neurogenesis. Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(13):7526-7531.
11 Gheusi G,Cremer H,Mclean H,et al. Importance of newly generated neurns in the adult olfactory bulb for odor discrimination. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(4):1823-1828.