白猫计划模板(10篇)

导言：作为写作爱好者，不可错过为您精心挑选的10篇白猫计划，它们将为您的写作提供全新的视角，我们衷心期待您的阅读，并希望这些内容能为您提供灵感和参考。

篇1

“志强，我们公司正缺设计人员，回来和我们一起干吧！”2003年，就在肖志强从美院毕业后，远在长沙创办广告公司的姐姐、姐夫让他回去帮忙。尽管留在北京对他有很大的诱惑，但再怎么也是给别人打工，而回长沙就是自己的事业了，更何况姐姐、姐夫还许诺给他20%的股份。所以，肖志强义无反顾地选择了回长沙！

几年前，姐姐和姐夫创办了“百色”广告公司，主要设计和平面媒体广告，在当地小有名气。而肖志强的加盟更是如虎添翼，三人分工明确，姐夫执掌公司运营，姐姐负责业务，肖志强则负责广告设计和制作。三人配合密切，不但令公司成员过着富足的生活，而且公司的名气节节上升。

2004年春节刚过，姐姐和姐夫就告诉他：他们移民澳洲的申请获得批准，决定长期在澳洲居住，准备将百色广告公司交给肖志强一人打理。

独掌偌大一个公司，肖志强心中有些忐忑，但更多的是豪情万丈：自己是设计部经理，不但在技术方面得心应手、游刃有余，而且作为公司的合伙人，对公司的状况也了如指掌。自己接管公司，虽然不能在短期内突飞猛进，但至少可以让良好的业绩持续下去。

然而，令肖志强始料不及的是，上任伊始便出师不利。

姐姐、姐夫离开后，管理、业务、设计全都由他一手抓，使原本一门心思专注于广告创意、制作的肖志强，一时间手忙脚乱。

业务部与设计部的矛盾也在悄悄滋生。2004年初，长沙国际名车展开展。凭着公司原有的知名度，业务人员力挫众多对手，取得了几家汽车厂家的广告权，但要求严格：必须在两天内提供广告设计样稿。可肖志强忙于公司管理，根本无暇再管理广告设计。结果，竟有一份在几次修改后，还是达不到客户要求而告吹。煮熟的鸭子，飞了！这一次，业务人员终于忍不住发难了，指责设计部全是靠他们养活，都是白拿工资的废物。

尽管以往也有设计部埋怨业务部反反复复、朝令夕改，业务部怪罪设计部拖拖拉拉、延误工期的事情发生，但当时两个部门分别由姐姐和自己掌管，底下员工偶有冲突，也不过是发发牢骚而已。可现在姐姐、姐夫的离开，使两个部门同时缺失了密切配合的主管，部门间的矛盾便渐渐由小变大、由暗地的互相埋怨转向公开的相互指责。

设计部为满足客户的要求筋疲力尽，业务部为着履行工期左右为难！

自从他加入公司后，就一直在设计部任职，朝夕相处，使他不自觉地偏袒设计部。潜意识的情感倾斜，很快就造成了重大损失，业务部的员工渐渐开始消极怠工。

离心容易重建难

发展受阻惨败收场

结果，公司业绩一落千丈，不但开发新客户受阻，就连老客户都似乎有慢慢流失的趋势。这时，肖志强才警觉到自己偏听偏信的后果。他想维护业务人员时，又使设计部陷入了备受冷落的状态。短短两个月，公司的消极情绪四处蔓延。

每天，肖志强不仅要负责业务，还要协调好两部门间的关系，他越来越觉得力不从心。无奈之下，他炒掉了几个业绩不好、总用理由搪塞的业务人员，也将设计部里几个恃才傲物的员工一并“忍痛割爱”了。

这样，两部门总可以和平相处了吧？然而，接下来的招聘工作，令肖志强几乎气馁。设计部倒还好说，毕竟他知道需要配置什么样的设计人员，而业务部的招聘工作却远没有这么顺利。开始招进来的一些业务人员，虽然工作积极，可惜业绩太差，大多数新进人员在试用期内颗粒无收，公司只是白白支付了两个月的薪水。

为了扭转局面，肖志强决定降低新进人员的薪水，增加招聘名额，以期全面撒网，重点培养。于是，公司由原来的18人暴增到28人。看起来公司又恢复了以前熙熙攘攘、欣欣向荣的光景，但是问题也接踵而至。

由于新员工的数量很大，直接管理就变得很困难，人员管理逐渐失去了控制。新老员工又存在着明显的隔阂，公司内部逐渐形成了一个个的小团体。同时，由于薪酬水平的降低，招聘的业务人员素质也随之降低，个别业务人员根本无法根据客户意图为客户设计可行性方案。众多意向性客户分布于各行各业，有些鉴于“百色”的知名度，勉强同意合作，但一段时间后，客户常常因收不到广告效果而终止合同。老客户也因新客户的良莠不齐对公司失去原有的信赖，渐渐疏于联络。

公司与一家报社的合同马上就到期了，报社欲对该栏目重新招商，要公司尽快拿出一套新的方案来。那天，肖志强特意主持了员工大会，希望大家献计献策。然而，令他吃惊的是，曾经可以为一项工作争论得面红耳赤的同事们，如今个个相敬如宾，一切唯他马首是瞻，没有疑义，也没有建议。结果一场讨论会竟变成了一场气氛沉闷的个人发言。

篇2

【关键词】 孕中期; 甲胎蛋白; 游离β人绒毛膜促性腺激素; 脐动脉血流; 多普勒; 不良妊娠结局

Abstract： 【Objective】 To investigate the clinical value of second trimester maternal serum screening and umbilical artery Doppler for prediction of adverse pregnancy outcome. 【Method】 A total of 876 women were taken blood sample during 14 to 21 weeks for the measurement of alpha fetoprotein and free β human chorionic gonadotropin with time-resolved fluorescence assay. Among them， 536 cases were measured the umbilical artery index with color ultrasound Doppler during 14 to 28 weeks. In the end， the pregnancy outcome was record and analyzed. We compared the difference of incidence of adverse outcome between the group of high levels of maternal serum markers (342 cases)， the group of abnormal umbilical artery index (82 cases)， and the group of both maternal serum markers and umbilical artery index were abnormal (40 cases). 【Result】 The high levels of maternal serum markers was significantly associated with preeclampsia， neonatal asphyxia， fetal growth restriction， fetal demise， and abnormal placenta. The incidence of associated adverse outcome was 12.65% in the group of high levels of maternal serum markers， 8.5% in the group of abnormal umbilical artery index， and 30.95% in the group that both maternal serum markers and umbilical artery index were abnormal. The adverse outcome incidence of the last group was significant higher than the former two. 【Conclusion】 High levels of maternal serum markers combine with abnormal umbilical index are associated with higher adverse outcome incidence.

唐氏综合征(Down?蒺s Syndrome，DS)是活产新生儿最常见的染色体疾病，其血清学产前筛查正在普及。目前我国大部分地区采用孕中期母体血清标志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、游离β人绒毛促性腺激素(free β human chorionic gonadotropin，free-β-hCG，以下简称hCG)二联生化指标筛查，以评估胎儿可能患唐氏综合征、18-三体综合征、神经管缺陷等疾病的风险率。近年来国内外研究表明，当不存在染色体异常及胎儿畸形时，母体血清标志物水平的异常升高与不良妊娠结局有着密切的关系[1-3]，于是孕早、中期母血清标志物对于不良妊娠结局的预测意义逐渐成为研究的热点。但由于仅仅使用血清标志物进行不良妊娠结局的预测存在特异度、阳性预测值不高的缺陷，对临床的指导意义有限。现阶段研究的重点逐渐转移至开发新的标志物，即与血清标志物联合使用时，能提高预测的效果，提高临床应用的价值。脐动脉血流与胎儿、胎盘血液循环密切相关，它反应了胎儿血液灌注情况。国内外大量文献报道脐动脉血流频谱异常的围产儿其胎儿窘迫发生率、新生儿窒息率、胎儿宫内发育迟缓率及围产儿死亡率均明显高于血流正常者[4-6]。母亲方面如子痫前期[7]、糖尿病等导致胎盘缺血、缺氧的疾病可以导致脐动脉血流频谱比值增高[8]。因此，通过对脐血流图分析，从而了解胎儿、胎盘循环阻力情况，对高危妊娠的监测及胎儿结局预后有重要的临床价值。脐动脉血流是否能作为与血清标志物联合用于评估母儿结局的指标，尚待进一步研究。而目前将血清标志物联合脐动脉血流用于监测胎儿结局的研究尚处于空白阶段。本文旨在探讨孕中期血清标志物(AFP、hCG)及脐动脉血流与不良妊娠结局的关系，评价二者联合用于预测不良妊娠结局的可能性及意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2006 年1月至2009年4月期间在中山大学附属第三医院进行如下检查的孕妇：妊娠14 ～ 21周血清学筛查(共876例);其中在妊娠14 ～ 28周彩超下行脐动脉血流监测(共536例)，并有分娩结局者。纳入标准：分娩的胎儿无染色体或结构异常者;单胎妊娠;汉族;排除行产前筛查时已患有本次研究中的产科并发症或病理妊娠的孕妇;排除IVF的孕妇;排除与AFP升高有关的疾病，如部分卵巢肿瘤、肝癌等。

1.2 诊断标准

主要观察的妊娠结局(及妊娠并发症)包括：子痫前期;胎儿生长受限;低出生体重儿;新生儿窒息;胎儿丢失;胎盘异常：包括前置胎盘、胎盘早剥、胎盘植入;早产;羊水过少;产后出血;妊娠合并贫血;妊娠期糖尿病;胎膜早破;脐带绕颈;内科合并症：包括肝功能异常、自身免疫疾病、妊娠合并性传播疾病等。以上妊娠结局(及妊娠并发症)的诊断参照乐杰主编的《妇产科学》第6版的标准。

1.3 方法及试剂

1.3.1 试剂及仪器

接受筛查者在孕14 ～ 21周期间，抽取静脉血2 mL。待自然凝固后分离血清，标本保存于-20 ℃冰箱，于1周内收集并由专人检测。筛查的血清标志物为AFP和Free-β-hCG。血清学分析测定使用广州市丰华生物工程有限公司生产的AFP和Free-β-hCG试剂盒，检测仪器采用泰莱Ⅱ型时间分辨荧光免疫分析系统，测定按操作程序严格进行质控，测定批内变异系数，不同批次试剂不混用，异常结果重复实验2次。运用风险评估软件计算上述两种标志物的中位数倍数(MoM)值，凡AFP≥2.0 MoM和/或hCG≥2.0 MoM的孕妇为血清学标志物升高者。采用珠海艾博罗生物技术有限公司提供的产前筛查软件系统。

应用PHILIPS公司彩色多普勒超声诊断仪常规检查胎儿，探头频率3.5 mHz。选择脐动脉近胎盘处进行多普勒检测，取样容积2.4 ～ 3.6 mm，角度 < 60°，连续出现3个以上相同波形时，测量S/D、RI、PI数值并记录(图1、2)。脐动脉血流的S/D、RI、PI正常值范围参照参考文献[9]。

1.3.2 研究方法

筛选不良妊娠结局：血清学标志物升高者包括单项血清hCG≥2.0 MoM、单项血清AFP≥2.0 MoM及两项血清标志物水平均升高，分析它们与血清学标志物正常者(hCG及AFP均 < 2.0 MoM)的上述妊娠结局(妊娠并发症)的发生率的差异，差异具有统计学意义的妊娠结局为与血清标志物升高有关的不良妊娠结局。比较血清标志物升高者、脐动脉血流异常者及两者同时异常者之间相关不良妊娠结局发生率的差异。

1.4 统计学方法

所有数据均输入EXCEL表格，采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析。各组数据所得结果中，计量资料用x ± s表示，计数资料用百分率(%)表示。计量资料采用t检验，计数资料采用四格表?字2检验、连续校正?字2检验及Fisher?蒺s精确概率法进行统计。P < 0.05时认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 研究人群的一般状况分析

总例数876例，其中血清学标志物升高者(以下简称升高组) 382例，血清学标志物正常者(以下简称正常组) 494例。升高组平均年龄(29.56 ± 3.72)岁，正常组(29.53 ± 3.50)岁，两者比较P = 0.880 > 0.05，无统计学差异;升高组平均体重(54.39 ± 9.22) kg，正常组(54.73 ± 6.97) kg，两者比较P = 0.537 > 0.05，无统计学差异;升高组平均筛查孕周(17.82 ± 1.83)岁，正常组(17.90 ± 1.85)岁，两者比较P = 0.502 > 0.05，无统计学差异。升高组中hCG≥2.0 MoM者285例，AFP≥2.0 MoM者76例，hCG及AFP均≥2.0 MoM者21例。

2.2 相关不良妊娠结局的筛选

比较血清标志物水平升高者(382例)与正常者(494例)之间不良妊娠结局的发生率。将血清标志物水平升高者中进行分组，分为hCG≥2.0 MoM，hCG≥3.0 MoM，AFP≥2.0 MoM，hCG和AFP同时≥2.0 MoM 4个组。比较4个组与血清标志物正常者之间各种不良妊娠结局及并发症的发生率。当hCG≥2.0 MoM时，子痫前期、新生儿窒息的发生率与正常者之间的差异有统计学意义;当hCG≥3.0 MoM时，胎儿生长受限及子痫前期的发生率与正常者之间的差异有统计学意义;当AFP≥2.0 MoM时，子痫前期的发生率与正常者之间的差异有统计学意义;当hCG和AFP同时≥2.0 MoM时，胎儿丢失、胎盘异常的发生率与正常者之间的差异有统计学意义。而其他9种不良妊娠结局或妊娠并发症的发生率在血清标志物升高者与正常者之间无明显差别。因此，与血清标志物升高有关的不良妊娠结局应包括子痫前期、新生儿窒息、胎儿生长受限、胎儿丢失及胎盘异常。

2.3 血清学标志物水平与不良妊娠结局的关系

比较血清学标志物水平升高组与正常组之间的上述筛选出的不良妊娠结局(即子痫前期、新生儿窒息、胎儿生长受限、胎儿丢失及胎盘异常)发生率的差异。血清学标志物水平升高者，即AFP≥2.0 MoM和/或hCG≥2.0 MoM者，共382例，其中发生相关不良妊娠结局者有56例，发生率14.67%;同期检测的血清学标志物水平正常者，即AFP和hCG均 < 2.0 MoM，共494例，其中发生相关不良妊娠结局者有25例，发生率5.06%。两组发生率之间具有统计学差异，P值为0.000，OR值3.223，95%置信区间(1.970-5.272)。

2.4 脐动脉血流异常与不良妊娠结局的关系

在876例孕妇中，共进行536例脐动脉血流监测。脐动脉血流异常组，即PI、RI、S/D三项中一项或几项异常者，共123例，其中发生上述相关不良妊娠结局者有20例，发生率16.26%;脐动脉血流正常组，即PI、RI、S/D三项均正常者，共413例，其中发生上述相关不良妊娠结局者有18例，发生率4.36%。两组之间不良妊娠结局发生率具有统计学差异，P值为0.000，OR值4.261，95%置信区间(2.175 ～ 8.350)。

2.5 两指标单项与二者同时异常与不良妊娠结局的关系

进一步比较血清学标志物或脐动脉血流单项异常，与两者同时异常之间不良妊娠结局的发生率，分别为43/340(12.65%)、7/82(8.5%)和13/42(30.95%)，可以发现，单纯血清学标志物升高或单纯脐动脉血流异常与两者同时异常者3组之间不良妊娠结局发生率有统计学差异，P值为0.007。两两比较，单纯血清学标志物升高与单纯脐动脉血流异常的不良妊娠结局发生率的差异没有统计学意义，P值为0.301;而血清学标志物升高组、脐动脉血流异常组与两者同时异常组不良妊娠结局的发生率的差别具有统计学意义，P值为0.002、0.001。

3 讨 论

近年来，一些学者观察到hCG水平显著增高的孕妇发生不良妊娠结局的几率明显高于hCG水平正常的孕妇。Ong等[10]测定5584例妊娠10 ～ 14周的母血hCG，然后随访妊娠结局，认为异常hCG水平与不良妊娠结局的发展有关。hCG水平的变化作为监测妊娠中母儿危险性的指标，其可能的病理生理基础为某些病理因素导致胎盘滋养细胞低氧环境，从而使滋养细胞大量地反应性增生，hCG产生增加，并分泌入血，使母血清中hCG水平升高。

血清AFP值可预测胎血甲胎蛋白值以及胎-母屏障的完整性和通透性。Alkazaleh等学者[11]对孕中期AFP的升高对不良妊娠结局的预测(包括FGR、早产、子痫前期、胎盘早剥)进行研究，认为可能是胎盘缺血-血栓形成而导致胎盘屏障的破坏，使得AFP由胎儿向母体循环输送增多的结果。而胎盘缺血-血栓形成可导致胎盘功能不全。Gkogkos 等[12]所做的前瞻性研究表明，中孕期母血AFP≥2.0 MoM时，联合其他胎盘功能检测项目，可有效检出严重胎盘功能不全及相关不良妊娠结局。

当脐动脉血流出现异常，反映了胎儿、胎盘循环量不足[13]。刘智等[14]研究表明，当胎盘小叶被结扎60%时，脐动静脉血流均有改变，因此，脐动脉血流反映了胎盘小叶的循环情况，如出现胎盘病理状态，如胎盘水肿、缺血、梗死等，达到一定的严重程度时，脐动脉血流将会出现异常改变。

本研究发现，子痫前期、胎儿生长受限、胎儿丢失、新生儿窒息及胎盘异常的发生率在血清标志物升高组与正常组之间的发生率是存在统计学差异的，而上述不良妊娠结局与胎盘功能不全有密切关系，因此，其病理生理基础可能为胎盘功能不全引起母血中血清标志物水平升高，而胎盘功能不全最终导致了上述不良妊娠结局。

将血清标志物升高用于预测不良妊娠结局，当两个标志物同时升高时，其预测不良妊娠结局的OR值最高(51.895)，相关的不良妊娠结局为胎儿丢失。而单个标志物升高预测不良妊娠结局的OR值则较低。因此，当有两个标志物同时升高时，我们首先应关注胎儿丢失的风险，其次为胎盘异常。

我们发现在比较不良妊娠结局的发生率时，使用单一指标血清标志物水平升高及脐动脉血流异常与两者联合相比，差异具有统计学意义，而将三者进行两两比较，两个单一指标与联合指标相比，差异均有统计学意义。说明在3种指标中，联合指标与不良妊娠结局的关系较两种单一指标更为密切。因此，将血清标志物与脐动脉血流联合用于预测上述不良妊娠结局，其效果应优于两种指标单独应用。至于其具体筛查效果如敏感度、特异度等，仍需进一步评估。

在临床工作中，如中孕期唐氏综合征筛查中血清标志物升高(≥2 MoM)，在排除了染色体及胎儿结构异常后，应密切关注孕14至28周的孕中期脐动脉血流检测，如有一项或多项指标异常时，与子痫前期、胎儿生长受限、新生儿窒息、胎盘异常或胎儿丢失的不良妊娠结局关系密切，应视为高危妊娠处理，告知患者相关风险，适当增加产前检查次数，注意与胎盘功能有关的检查如彩色多普勒超声观察胎盘形态、复查脐动脉血流等。

参考文献

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篇3

研究目的：本研究拟在大肠杆菌中表达FimA蛋白并进行蛋白纯化。为后续实验制备抗FimA蛋白的多克隆抗体提供实验基础。

研究方法：1. 以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS为宿主菌，用IPTG诱导fimA表达，通过SDS-PAGE和Western blot来验证蛋白的表达结果，并进行蛋白表达形式分析。2. 大量诱导表达融合蛋白，用Co2+柱亲和层析纯化表达产物，通过SDS-PAGE和Western blot来验证纯化产物，纯化产物经透析复性后用BCA法蛋白定量试剂盒作蛋白含量测定。

研究结果：1. 经IPTG诱导表达后，工程菌在SDS-PAGE上出现一条新蛋白带，分子量与预期大小基本一致（约41kDa），IPTG浓度及诱导时间对融合蛋白表达量影响较大：当IPTG浓度为2 mmol/L，诱导时间为3 h时蛋白表达量最大；当IPTG浓度为1 mmol/L，诱导时间为1 h时蛋白表达量最小。6×His-FimA表达产物经SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜，X线片感光，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，而空质粒pET-15b对应位置未见特异条带。蛋白表达形式分析结果表明表达的融合蛋白位于包涵体中。2. 表达产物经Co2+柱亲和层析， SDS-PAGE上出现一致的单一条带，其分子量大小与预期相符（约41kDa）。6×His-FimA纯化产物经SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜，X线片感光，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，条带位置与BL21(DE3)pLysS全菌诱导表达后相应蛋白位置一致。经BCA法蛋白浓度定量试剂盒对纯化后的蛋白质进行定量分析，计算出纯化后的FimA蛋白浓度为0.96 mg/ml。

主要结论：用本课题组前期构建的fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后，fimA基因能够得到正确表达。表达产物经Co2+柱亲和层析，可以得到带6×His标签的FimA融合蛋白。

1 绪论

慢性牙周炎是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，在我国有很高的发病率，严重影响国民健康水平。牙周炎造成的牙周组织的破坏是持续性的，一旦发生，目前的治疗手段还不能使牙周组织达到完全的恢复。牙周炎还可能是某些系统性疾病的危险因素。随着我国经济的发展、人民生活水平的提高和人群寿命的延长，对牙周健康状况的关注日益提高。因此，探索预防慢性牙周炎的有效途径对于提高国民健康水平具有重要意义。

疫苗在人和家畜疾病防治方面具有极大的作用，是一种有效的防治疾病的手段。从减毒活疫苗、死疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗到DNA疫苗，由于技术不断改进，使得疫苗有了广泛的应用，被成功的用于许多细菌或病毒感染的防治，因此以疫苗来防治牙周炎也已成为一个重要思路。

慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis， Pg)是其主要可疑致病菌[1]。菌毛是Pg表面主要毒力因子之一，菌毛蛋白(fimbrillin，FimA)是其主要亚单位，能够介导Pg对宿主组织的粘附与入侵，以及与口内其他细菌的粘附共聚[1-3]，还能刺激炎性因子的产生[4]。多菌毛Pg野生型菌株可引起定菌大鼠牙槽骨吸收，而无菌毛的突变菌株则不会造成牙槽骨的破坏。也有实验发现，用FimA免疫大鼠可减轻由Pg引起的牙槽骨破坏[5]，将抗FimA的单克隆抗体用于口腔被动免疫，可以抑制该菌在口腔的定植[6]。因此，可以将FimA作为防治牙周炎疫苗抗原。

Pg菌毛的单体是FimA，由单拷贝fimA基因编码。fimA基因全长1290 bp，开放读框包括1044 bp，编码347个氨基酸。翻译后产物菌毛蛋白的功能域（如刺激T细胞和B细胞的位点、刺激细胞因子产生的位点等）位于氨基酸序列的31～331aa不等，各个位点之间可相互交叉或覆盖。近年来由于分子生物学和免疫学的发展，fimA基因已被克隆和测序，对蛋白质分子中的各个功能区、抗原表位已有了更深入的了解，为研制疫苗提供了可靠的依据。

根据国内外研究进展，在前期已构建fimA原核表达质粒的基础上，本研究拟在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中表达FimA融合蛋白，并通过金属螯合亲和层析技术进行纯化，为后续实验制备抗FimA蛋白的多克隆抗体、研发用于人类的、可有效防治牙周炎的DNA疫苗提供实验基础。

2 文献回顾

牙周炎是口腔疾病中的常见病和多发病，在我国有很高的发病率[7]。牙周炎累及牙齿数目多，预后差，是造成牙齿缺失的主要原因。随着我国进入老龄化社会，牙周炎的预防将成为突出的保健问题。世界卫生组织已将牙周组织健康列为健康人的十项标准之一[7]。探索预防和治疗这种严重危害人类口腔健康的疾病的方法，对于改善我国人民的口腔健康水平，提高人们的生活质量有着重要意义。

大量的实验研究、流行病学资料和临床观察表明[7]，牙周炎是菌斑微生物引起的感染性疾病。菌斑微生物是引发牙周炎的始动因子，是造成牙周组织破坏的必须因素。牙周菌斑中绝大多数细菌为口腔固有菌丛，对宿主无不良影响，仅少数细菌与牙周炎的发生、发展密切相关。其中牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis， Pg）是目前获得公认的一种牙周致病菌，它是牙周病，尤其是成人慢性牙周炎病变区或活动部位最主要的优势病原菌，而健康龈沟内很少[7， 8]。目前牙龈卟啉单胞菌也是牙周微生物学领域重点研究的厌氧菌之一。除口腔疾病外，在全身系统性疾病的研究中，血清学、动物模型、细胞培养的研究证实[9-11] Pg感染与心脑血管疾病的发生有关，而且有学者报道[12]Pg的感染与低体重婴儿的分娩也有关。

Pg含有大量毒性因子，如蛋白酶、菌毛、脂多糖、血凝素等。其中菌毛在牙周致病作用中占据重要地位，而且与Pg在口腔的定植有关，为Pg的优势抗原之一。另外，因其具有广泛的生物学活性而成为牙龈卟啉单胞菌研究的一个热点。

菌毛（pili，fimbriae）是位于革兰氏阴性菌Pg菌体表面的一种弯曲的、单股的丝状物，长0.3～1.0 μm，直径为3.5～5.0 nm，遍布细菌表面，多者每菌可有数百根，由菌体表面伸向细胞外。其化学组分是一种蛋白质，与细菌的运动无关。

2.1 菌毛的致病机制 2.1.1 介导Pg附着于口腔

Pg附着于宿主组织表面是其定植于口腔的关键，也是其致病的先决条件。Pg可选择性的直接附着于口腔内特定部位组织的表面，或识别已经附着在组织表面的细菌，然后间接的附着于组织表面。

1）菌毛可介导Pg附着于口腔内各种组织细胞的表面

菌毛可介导Pg黏附于龈沟液中的成分（如人血红蛋白和纤维蛋白原）；唾液中的重要蛋白质成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG、富酪蛋白PRT）；乳铁转运蛋白，细胞外基质蛋白（ECM）（如玻连蛋白和纤维连接蛋白）。人细胞外基质蛋白通过与FimA受体配体的结合在细胞外信号转导中起重要作用。菌毛对基质蛋白有很强的亲和力，而且明显抑制玻连蛋白/纤维连接蛋白与其受体αβ3和配体α5β（在中国仓鼠卵巢CHO细胞株中过度表达）的相互结合。在牙周组织中，菌毛可能通过细胞外基质蛋白受体/配体途径阻断细胞外信号转导。

菌毛还可介导Pg黏附于牙龈上皮细胞、牙周袋上皮细胞、人口腔上皮细胞、人脐静脉内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞，附着并凝集人或羊的红细胞等。Umemoto[13]构建了无菌毛的Pg突变株，发现其对人口腔上皮癌细胞的黏附性和侵袭性均降低，接种小鼠后引起牙槽骨丧失的量也减少。其他学者构建了不表达菌毛的Pg缺陷株，发现它们黏附和侵袭人牙龈成纤维细胞[14]、上皮细胞[15]、内皮细胞[16]和树突状细胞[17]的能力也降低，甚至不能黏附。这些研究结果说明菌毛在Pg黏附于口腔上皮细胞的过程中起重要作用。

此外，研究发现Pg可黏附于唾液覆盖的羟基磷灰石（hydroxyapatite coated with saliva，sHAP），这种黏附活动常被作为研究Pg与口腔内唾液覆盖的各种组织细胞黏附活动的模型。Lee[18]等的研究发现，Pg与羟基磷灰石之间的这种黏附活动需要菌毛参与，而且抗菌毛的抗体能完全抑制这种黏附作用。学者们[14， 16]通过同源重组技术灭活fimA基因后，发现突变株与sHAP的黏附能力降低。这些研究结果提示FimA菌毛蛋白在Pg黏附到唾液覆盖的口腔内各种组织表面的过程中起重要作用。

2）在菌斑形成的早期，菌毛可介导Pg黏附于附着在获得性膜表面的细菌，间接的附着于组织表面

细菌之间的相互黏附和共聚有助于早期生物膜的形成。链球菌是最先定植于牙齿表面的主要细菌，Pg通过菌毛与链球菌细胞表面的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）高亲合力、高特异性的结合而与链球菌发生共聚，这种相互作用在Pg定植于牙周袋的过程中可能起重要作用。此外菌毛还参与Pg与放线菌、福赛氏类杆菌之间的黏附过程。

3）有关黏附机制的研究

现在已经明确Pg黏附于口腔的过程为一种特异性识别过程，菌毛可能为特异性配体，与宿主细胞膜上的特异性受体相互作用[7]。部分Pg菌毛可识别的黏附受体现已明确，如βintegrins[7，19]、上皮细胞的细胞角蛋白14[20]、巨噬细胞（MCs）上的TLR2和CD14[7]。菌毛通过上皮细胞的βintegrins促进Pg与牙龈上皮细胞的黏附，抗βintegrins的抗体能抑制Pg的黏附和侵袭[19]。Pg菌毛通过单核细胞上的TLR2、CD14和CD11a/CD18，诱导外周血单核细胞IL-6 mRNA的产生、细胞因子的分泌、p38促有丝分裂蛋白激酶磷酸化和NF-κB的活化。小鼠腹膜巨噬细胞的实验研究表明，β2 integrins（CD11/CD18）是小鼠腹膜巨噬细胞与Pg菌毛黏附的细胞受体；而且β链（CD18）在信号转导中起关键作用。

综上所述，菌毛可介导Pg黏附于龈沟液中的成分（如人血红蛋白和纤维蛋白原）；人唾液成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG）；乳铁转运蛋白、细胞外基质蛋白；宿主细胞（如牙龈上皮细胞、牙周袋上皮细胞、成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞，巨噬细胞等）；口腔内的细菌（如链球菌、放线菌、福赛氏类杆菌）。借助于菌毛黏附于这些物质，Pg可在口腔内进一步定植、侵袭、诱导炎症反应的发生。

2.1.2 引发炎症反应和免疫反应

Pg附着于口腔内组织细胞后，其抗原成分和毒性产物等可引发白细胞的趋化、吞噬等炎症过程，造成表面组织的损伤——其中Pg菌毛能与脂多糖一起激活宿主的防御机制、诱导多种炎性细胞因子的产生；此外细菌及其产物还通过上皮细胞或者细胞间质进入表层下组织，在组织内繁殖，甚至扩散至全身。

1）Pg菌毛的白细胞趋化作用

牙周炎再现了一种重要的中性粒细胞介导的破坏宿主组织细胞的模型。牙周炎的优势病原菌P生的毒力因子主要就是用于调节中性粒细胞的反应。其中Pg菌毛能诱导多种可趋化白细胞至炎症部位的细胞因子的分泌。

Pg菌毛可诱导内皮细胞表达趋化因子IL-8（Interleukin-8）和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）：感染了野生型Pg的人脐静脉血管内皮细胞持续低剂量的表达IL-8和MCP-1，而Pg的fimA基因突变株则不能诱导IL-8和MCP-1产生。同时，抗菌毛的特异性抗体也能阻断上述因子的产生。这些提示IL-8和MCP-1的产生是由菌毛特异性引起的。

IL-8和MCP-1都是诱导白细胞到免疫反应部位的有效的趋化因子。MCP-1又称单核细胞趋化激活因子（monocyte chemoattractant activating factor， MCAF），它作为趋化因子超家族的一个主要成员，可以由机体多种细胞合成和分泌（如人牙龈上皮细胞），是重要的炎性细胞因子，在机体对入侵的病原微生物的炎症反应和免疫反应中，起重要调节作用。MCP-1的主要生理作用是特异性的趋化中性粒细胞和巨噬细胞向炎症部位聚集， 同时还有激活巨噬细胞的功能。而且炎症部位的细胞因子如IL-1、TNF-α等可以刺激机体的免疫细胞及其他细胞表达MCP-1，该过程中所产生的MCP-1能进一步特异性的趋化巨噬细胞和单核细胞向病损部位聚集。中性粒细胞和巨噬细胞向炎症部位聚集，是炎症反应中的一个重要过程。巨噬细胞是参与牙槽骨代谢的重要的免疫细胞，被激活的巨噬细胞能产生大量的骨吸收性细胞因子。也有学者认为巨噬细胞是破骨细胞的前体细胞，在破骨细胞分化因子的存在下，体外培养的巨噬细胞可以向破骨细胞分化。而牙槽骨的吸收是牙周病的一个重要病理特点，是病变进程、发展和愈后的一个重要指标。这些提示Pg菌毛能通过免疫细胞及其他细胞产生的MCP-1间接的趋化巨噬细胞向炎症部位聚集，增加破骨细胞的数量，促进破骨细胞的分化和成熟，进而促进牙槽骨的吸收。

Pg菌毛可诱导内皮细胞表达粘附分子ICAM-1、VCAM-1和选择素（selectin）：Pg菌毛诱导人脐静脉内皮细胞表达细胞内黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）以及P-selectin/E-selectin。而且加入按照人工合成的菌毛氮末端氨基酸序列多肽能上调上述分子的表达，而Pg 的fimA基因突变株或含有抗Pg菌毛蛋白抗体的血清与人脐静脉内皮细胞共培养时，不能诱导上述分子的表达。

内皮细胞通过上述分子selectin，ICAM-1和VCAM-1可诱导和趋化血液循环中的白细胞黏附至内皮细胞。其中选择素是血管粘附分子大家族中的一大类成员，根据表达部位可分为三类[21]：表达于活化的内皮细胞表面的E-selectin；表达于白细胞表面的L-selectin；表达于活化的血小板和内皮细胞表面的P-selectin。在感染以及其他炎性反应发生过程中，selectin通过与其相应配体结合介导白细胞（中性粒细胞、T-和B-淋巴细胞以及单核细胞等）与血管壁（特别是毛细血管后静脉）接触，并使白细胞在血管壁上缓慢滚动，从而启动一系列反应，最终导致白细胞在炎性反应区域集中。ICAM-1也可促进白细胞黏附、移动和趋化至炎症部位。血液循环中的单核细胞和白细胞黏附和趋化至内皮细胞，然后穿过内皮细胞在局部聚集是炎症反应的重要过程。Pg菌毛通过诱导内皮细胞所表达的selectin、VCAM-1和ICAM-1，趋化单核细胞和白细胞至炎症反应的局部，可能在牙周病中起重要作用。

2）Pg菌毛诱导多种炎性细胞因子的产生

（1）Pg菌毛诱导外周血单核细胞产生炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和化学趋化因子IL-8，诱导p38促有丝分裂蛋白激酶磷酸化，刺激单核细胞诱导的细胞核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）p50和p65亚单位的活化（通过TLR信号转导途径），从而诱导高滴度的NF-κB依赖性细胞因子的释放。NF-κB是细胞中一个重要的转录调节因子，是Rel家族的成员，几乎存在于所有细胞中，在免疫反应、应激反应、细胞凋亡及病毒复制的调节中起主导作用，可在炎症部位高度表达，提示其在免疫反应和炎症反应中起着关键作用。受NF-κB调节的炎性细胞因子有：肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α和TNF-β）；粘附分子（ICAM-1，VCAM，E-selectin）；白介素（IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-12）；集落刺激因子（CSF）（粒细胞-CSF，粒细胞和单细胞-CSF）；β-干扰素（INF-β）等。因此，NF-κB是多种促炎症基因高度转录的必须因子。同时，由NF-κB调节的产物，如TNF-α和IL-1β又能激活NF-κB，这就意味着存在一个能放大且延续炎症反应的复杂的调节环路。

（2）Pg菌毛还能通过TLR2信号途径诱导小鼠腹膜巨噬细胞产生RANTES、INF-γ、IL-17、VCAM-1、血管内皮细胞生长因子，诱导MCP-1 mRNA的强表达。CD18可能在相关的信号转导机制中起重要作用。Pg菌毛可诱导巨噬细胞样细胞株U937表达IL-1β，IL-8，IL-12和TNF-α。fimA基因正常表达的Pg菌株能诱导单核细胞来源的树突状细胞表达炎性细胞因子TNF-α、IL-6，免疫调节细胞因子IL-10和趋化因子IL-8，而fimA基因的突变菌株Pg DPG3就不能诱导上述细胞因子的表达。而且用菌毛蛋白刺激单核细胞来源的树突状细胞，能在自体混合淋巴细胞反应（MLR）和自体的CD4+ T细胞中诱导以IFN-γ为主要细胞因子的Th1-型免疫反应。

关于菌毛诱导各种炎性细胞因子的产生的机制，Hajishengallis[22]的研究表明：体内免疫系统的Toll-like receptors（TLRs）和其他模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs）组成了一种功能性受体复合物，识别并对病原菌相关模式分子（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）起反应。在这种相互作用中，菌毛作为一种病原菌相关模式分子与宿主细胞的模式识别受体复合物相结合。CD14和CD11b/CD18是一种募集性受体，TLRs则是一种信号转导受体。TLR2和TLR4与介导菌毛活化细胞有关，其他的模式识别受体如CD14和CD11b/CD18与介导细胞对菌毛的识别有关。菌毛通过激活TLR信号转导途径，诱导单核细胞产生炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和化学趋化因子IL-8，并诱导抗原呈递细胞中协同刺激性分子CD40、CD80和CD86表达的上调。此研究结果也提示菌毛对宿主免疫系统有潜在的“危害”。

3）Pg菌毛诱导多种与调节骨代谢有关的细胞因子的产生，改变牙槽骨的代谢，诱导骨的吸收

Pg菌毛所诱导产生的细胞因子如IL-1、TNF-α是骨重建中重要的局部调节因子，在牙槽骨的吸收破坏中起重要作用，可促进结缔组织基质的降解，刺激骨的吸收，与牙周炎密切相关[1]；IL-1、IL-8、TNF-α等细胞因子还可通过自分泌和旁分泌途径，刺激更多的IL-1、IL-8、TNF-α的产生，使炎症加重和扩大，引起组织的进一步破坏。提纯的菌毛蛋白还能浓度依赖性的诱导肝细胞生长因子HGF/SF的产生。HGF/SF，也名为趋化因子SF，由间充质细胞产生，主要作用于上皮细胞，与刺激破骨细胞的活化有关。

Evans[23]研究发现表达菌毛的Pg能诱导无菌鼠牙槽骨丧失，而不产生菌毛的Pg诱导无菌鼠牙槽骨丧失的能力显著降低，而且用提纯的菌毛蛋白免疫无菌鼠可预防Pg所导致的牙周组织的破坏。这也证实了菌毛与牙槽骨的吸收密切相关。

4）Pg菌毛抑制单核细胞和巨噬细胞的凋亡

单核细胞和巨噬细胞的凋亡可能与慢性炎症性疾病密切相关。在缺乏生长因子的培养液中，Pg菌毛蛋白可抑制人单核细胞THP-1的凋亡。这种抑制作用能被抗菌毛蛋白的抗体所完全抑制。菌毛可激活细胞外信号传导激酶（signal-regulated kinase，ERK），刺激细胞内依赖细胞周期的蛋白激酶抑制剂p21的表达，从而阻断单核细胞和巨噬细胞的凋亡，提示菌毛可阻断单核细胞和巨噬细胞的凋亡，是慢性炎症性疾病牙周病的一种重要的调节分子。

5）Pg菌毛诱导免疫反应

慢性牙周炎与牙龈卟啉单胞菌感染不成熟树突状细胞（dendritic cells，DCs）、诱导真皮下DCs和基底膜中成熟的DCs数量的增加有关。Jotwani[24]的研究证实fimA基因正常表达的菌株Pg381与fimA基因的突变菌株PgDPG3相比，能更高效进入单核细胞来源的树突状细胞（monocyte-derived dendritic cells，MDDCs）中，诱导DCs的成熟。Pg381感染MDDCs后，能诱导高水平的自体混合淋巴细胞反应，诱导Th1-型免疫反应。用菌毛蛋白刺激MDDCs，也能诱导DCs成熟，而且成熟的MDDCs还能诱导自体同源性CD4+T细胞的增殖，γ-干扰素（gamma interferon，IFN-γ）的释放。这些结果提示Pg菌毛可能在诱导MDDCs吞噬Pg和诱导Th1-型免疫反应中起重要作用。

Amano[25]报导在牙周炎病人体内能检测到高滴度的抗菌毛的特异性IgG和IgA抗体。Condorelli[26]报导在牙周炎病人71.7%活动性位点和58.7%非活动性位点的龈沟液（gingival crevicular fluid ，GCF）中能检测到抗Pg菌毛的特异性IgA抗体，而在健康对照组的所有位点的GCF中均不能检测到抗菌毛的特异性IgA抗体。这些流行病学研究的结果表明Pg菌毛具有良好的免疫原性，能在体内诱发免疫反应。

Pg菌毛所诱导的免疫反应具有保护作用：Evans[23]等用提纯的菌毛蛋白和一种人工合成的20个氨基酸的菌毛多肽免疫无菌鼠后，鼠血清中抗菌毛的特异性抗体滴度较用全菌免疫后鼠血清中的抗体滴度高3～4倍。当给无菌鼠口腔接种Pg后，菌毛免疫鼠的牙周组织未受到破坏。Yanagita[27]以菌毛蛋白鼻腔黏膜免疫小鼠（霍乱毒素CT为免疫佐剂），能在黏膜效应组织（包括鼻腔通道，颌下腺）的CD4+T细胞诱导Th1-/Th2-型免疫反应。而且颌下腺产生的抗原特异性的IgA多克隆抗体可抑制Pg黏附于上皮细胞，减少上皮细胞细胞因子的产生。提示菌毛是一种有潜力的研制牙周炎疫苗的候选免疫原。

6）Pg菌毛诱导泡沫细胞的形成

有学者报导Pg的感染与动脉粥样硬化[28]的发生有关。动脉粥样硬化是一种由血管壁开始的慢性炎症性反应，其中泡沫细胞的形成是其重要特点。Giacona[28]研究证实人体巨噬细胞在感染野生型Pg后，形成泡沫细胞的量明显增加，但是感染fimA基因的突变菌株Pg DPG3后没有明显的变化，提示菌毛是Pg诱导泡沫细胞形成的必须因素，Pg菌毛可能与动脉粥样硬化的发生有关。

2.2 有关fimA基因表达调控的研究进展

Pg fimA基因的表达途径有以下三种[29]（按照表达和装配系统分类）：陪伴/引导分子途径系统、第二分泌系统、核化依赖聚合系统。fimA基因表达的初始产物具有非常长的前序列。Pg蛋白酶参与fimA基因的翻译后处理、转运和装配[29]。fimA基因的表达还受到以下因素的影响。

1）局部理化环境对Pg fimA基因表达的影响

研究表明[30]，Pg fimA基因的表达及菌毛依赖性表型的活性均受到温度、离子浓度等环境条件的影响。

龈下区的温度并不恒定，常随牙齿部位及炎症程度而变[31]，健康龈下区温度一般在34℃～37℃，而炎性牙周袋内温度　可达39℃。Xie等[32]通过fimA启动子-lacZ受体基因融合研究环境因素对Pg fimA基因表达的影响时，发现当龈下区温度由34℃升至39℃时，Pg fimA基因表达可减少至1/10。Murakami等[33， 34]的研究同样证实温度升高时，基因fimA的表达水平降低。Amano等[35]报导温度从37℃提高到39℃时，Pg对唾液成分和链球菌的黏附能力降低，Pg在牙周炎病人的血清中的抗原性发生改变。温度影响DNA的超螺旋结构，改变组蛋白与DNA结合的活性[36]，从而降低基因转录的速度[37]。Pg根据温度的变化来调整fimA基因表达的水平，可能是在机体感染Pg早期，fimA基因表达水平较高，有利于Pg黏附及侵入牙周组织；随着炎症程度加重、牙周袋形成和局部温度升高，菌毛的产生受到遏制，从而使菌毛的某些功能特性发生改变，而有利于Pg的生存。

基因fimA的表达还在转录水平受氯化高铁血红素浓度的调节[38]。铁在Pg的生长繁殖和毒力中起关键作用，Pg以血红素的形式吸收铁[39]。McKee[40]等发现，Pg在氯化高铁血红素过量时，毒力增强。在氯化高铁血红素不足时，Pg生长速度降低，Pg菌体表面菌毛数量减少[40]，血凝素基因hagB和hagC的mRNA表达水平降低[41]，但是，致病因子如溶血素和胰蛋白酶样蛋白酶等的数量及其致病毒力均明显增加[42， 43]。为进一步阐明氯化高铁血红素在调节fimA基因表达中的作用，Xie等[38]研究了fimA基因的转录活性，结果显示在缺乏氯化高铁血红素的情况下，fimA启动子活性降低50%，表明氯化高铁血红素可以对Pg fimA基因表达起正调控作用。但是这种调控作用不如温度变化对其影响的程度明显。虽然在氯化高铁血红素缺乏时，Pg的生长速度降低，但此时fimA启动子活性降低与Pg生长速度的降低并没有直接的联系[38]，fimA启动子的活性并不依赖于Pg的生长阶段。氯化高铁血红素调节Pg fimA基因表达的具体分子机制仍不清楚，许多受离子调控的基因在其启动子区均存在“离子盒”，而在fimA启动子区并没有与此具有同源性的区域结构[44]。推测可能是由于Pg多种致病因子基因的表达共同受到氯化高铁血红素的调节所致。

影响Pg fimA基因表达的局部理化环境还包括血清、唾液、渗透压、Ca2+浓度以及pH值等。

关于Pg如何感受到环境的变化，并把这种信息传递给细胞的机理并不完全清楚。但是研究发现信号转导系统的两种成分FimS-FimR与Pg fimA基因的表达有关[45]。FimS是一种组氨酸蛋白激酶基因的等位基因，FimR是反应调节基因的等位基因[45]。FimS 和FimR的分裂会导致菌毛形成量的明显降低。fimA基因的表达可能受到FimR反应调节器的正调控[46]。FimR调控包括fimA基因位点周围的5个成串的基因——fimA cluster在内的多个基因的表达。染色体免疫沉淀反应和电泳分析表明，菌毛蛋白黏附到fimA cluster中的第一个基因的启动子区域。突变菌株的基因表达分析表明，fimA基因转录过程包括多个步骤，FimR基因上调fimA cluster中的第一个基因的表达，而此基因编码一个在fimA基因的表达中起关键作用的调控蛋白。

2）其他口腔微生物对Pg fimA基因表达的调控

牙菌斑是一种附着了各种细菌的生物膜，这些菌斑微生物之间可以通过细胞间信号转导机制互相影响。Pg通过与获得性薄膜中的唾液分子[25]或者先前定殖的细菌如口腔链球菌[1]相接触而定殖于牙菌斑生物膜中，然后与牙菌斑生物膜中的其他微生物共生。但是，Pg不能聚集于链球菌突变株或者S.cristatus这一底层的上面[47]。针对这一现象的进一步研究揭示链球菌S.cristatus CC5A能明显降低Pg的fimA基因的表达水平，其浓度与fimA基因表达水平呈负相关，浓度升高时甚至可使fimA启动子活性下降1/2[48]。但是，在实验中尚未发现菌斑中的其他细菌，如纤细链球菌G9B和M5、血链球菌10556、变形链球菌KPSK2、内氏放线菌NC-3、齿垢密螺旋体GM-1以及具核梭杆菌10953等对fimA基因的表达具有这种调控作用[49]。

目前的研究结果认为，S.cristatus CC5A与Pg之间的这种信号转导开始于Pg受体对CC5A信号的识别[47]。信号分子是链球菌S.cristatus细胞膜表面的一种分子量为59kDa的CC5A蛋白，与其他革兰氏阳性菌分泌的短信号肽有明显区别[49]。菌毛自身并非受体，fimA基因突变的Pg株与CC5A蛋白的结合与野生型Pg菌株与CC5A蛋白的结合没有区别。这些结果表明，早期共生菌斑和后期致病性菌斑中的许多细菌并不影响fimA启动子转录的活性，不影响Pg菌毛的产生，因而能够与Pg相互共存。但是，S.cristatus CC5A能特异性地使Pg fimA表达水平降低，从而影响菌毛的产生，阻止Pg在菌斑内的进一步的繁殖。

3）Pg自身产物对fimA基因表达的调控

目前，定点诱变试验表明[50]，在fimA基因上游区域存在一个σ70-识别的RNA聚合酶结合位点，研究证明，调节蛋白能够与此位点特异性的结合，从而影响RNA聚合酶的功能。Xie等[48]发现有三种蛋白可结合于fimA基因，分别是菌毛蛋白、赖氨酸蛋白酶（Kgp）以及精氨酸蛋白酶（Rgp）的翻译后处理片段。

将外源fimA启动子-LacZ受体插入携带fimA突变基因的Pg菌株内，结果发现插入的外源性fimA启动子不能活化，fimA mRNA表达水平低；但若仅使fimA结构基因上游区域产生突变，则不影响启动子的活性，fimA mRNA的表达水平与野生型菌株相同[48]。提示fimA基因在表达过程中，表达产物可作为调节蛋白与自身启动子上游区的RNA聚合酶结合位点结合，从而正反馈性调节Pg fimA基因的表达。

Pg的半胱氨酸蛋白酶（Rgp和Kgp）也参与调节fimA基因的表达。有研究[51]报道当rgp表达水平较低时，Pg表面菌毛数量减少。rgpA和kgp基因失活的Pg菌株YPP1和YPP2与野生型Pg相比，fimA mRNA表达水平明显降低[52]。Pg 381的rgp A基因突变的变异株不表达菌毛，rgpB基因变异菌株表达的菌毛水平较野生型菌株低[48]。Tokuda[53]等也证明rgpA单基因突变菌株的fimA mRNA表达水平下降，表达的菌毛蛋白很少，通过Western印迹分析不能检出菌毛蛋白，其表面的菌毛通过电镜也无法观测到。菌株Pg 33277 的rgpA和rgpB双基因缺陷变异菌株则不表达菌毛[48]。这些研究结果均证明蛋白酶可在转录水平直接影响菌毛蛋白的产生。此外，在菌毛蛋白翻译后修饰加工的过程中，Pg蛋白酶还参与到对菌毛蛋白N-末端氨基酸的修饰加工。

这些资料均表明包括菌毛蛋白、Rgp和Kgp蛋白酶在内的几种Pg来源的蛋白都是fimA基因表达调控系统的组成部分，它们能够与fimA基因的上游区域结合，从而影响fimA基因的mRNA表达水平。

综上所述，影响Pg fimA基因表达的因素有：局部理化环境，包括温度、氯化高铁血红素的浓度、血清、唾液、渗透压、Ca2+浓度以及pH值等；牙菌斑中的细菌如S.cristatus CC5A；Pg自身产物，如菌毛蛋白、Rgp和Kgp蛋白酶等。如能对fimA基因的表达过程详细研究，在fimA基因转录的过程中加以某种干预，使Pg菌毛蛋白的转录、翻译水平降低，或者使fimA基因翻译后的修饰加工过程受到干扰，使菌毛所介导的Pg的黏附、侵入降低，病理性作用减少，就有可能降低Pg相关性牙周炎的发病率和严重性，这也是未来的一个研究方向。

2.3 有关fimA基因分子克隆的研究进展

Dickinson等[54]1988年首次克隆并测序了Pg381 fimA基因。Fujiwara等[55]1993年克隆并测序了9种Pg菌株的fimA基因，结果揭示这9种Pg菌株的fimA基因覆盖1044～1083 bp，所编码的多肽分子量为37，527～38，239，菌株之间有一部分相同的序列，同时具有大量的不同序列。Fujiwara[55]首次按照fimA基因核苷酸序列的不同，将Pg分为4种基因型。

Sharma等[56]1993年首次用表达载体pET-lld，大肠杆菌BL21表达了Pg 2561的部分菌毛多肽（氨基酸10～337）。Washington等[57]1993年用表达载体pET-lld，大肠杆菌BL21表达了Pg 381 fimA的一部分片段（1 kb）（fimA基因全长为1044bp）。

Sharma等[58]1996年首次构建了表达部分菌毛多肽的重组链球菌——一种活载体疫苗。以pUC13Bg12.1为模板，将编码Pg 2561 FimA蛋白部分肽段（N-末端55～145[90个aa]和C-末端233～322残基[89个aa]）的基因，PCR扩增后，定向插入到链球菌（Streptococcus gordonii）M6基因（emm6.1）的Kpn I-Hind III位点，获得融合表达质粒pSMB55，然后转染于口腔链球菌（S. gordonii GP251）中，制备为一种以细菌为载体的基因工程减毒活疫苗。在链球菌M6蛋白（氨基酸1～122和302～441）的锚定区，表达菌毛多肽（氨基酸55～145和233～322），形成一种融合蛋白。此链球菌所表达的菌毛多肽可竞争性的抑制Pg结合于唾液覆盖的羟基磷灰石上。而且将此疫苗菌株口腔内免疫无菌鼠后，可诱导血清异性IgA、IgG抗体和唾液异性IgA抗体的产生，并能防止Pg所导致的牙槽骨的吸收[59]。Sharma等[60]1999年进一步在链球菌Streptococcus gordonii表面，表达FimA蛋白的C-末端多肽（226～246），但是实验证实这种包含游离半胱氨酸残基的多肽在链球菌的表面表达很弱。

Kawabata等[61]1999年以克隆质粒pSM36为模板克隆了fimA基因，以真核表达质粒pcDNA3首次构建了fimA核酸疫苗pcDNA3/fimA。体外转染NIH3T3真核细胞后，可检测到菌毛蛋白的表达，说明了在真核细胞中表达FimA蛋白的可行性。定向唾液腺（TSG）免疫BALB/c小鼠后，成功的诱导了体液免疫和细胞免疫，在唾液和血清中能检测到特异性抗体。免疫后的小鼠，血清中抗FimA特异性IgG抗体主要的亚类是IgG2a，唾液腺单核细胞Th2-型细胞因子特异性mRNA增加，脾中产生抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞。

Shin等[62]2005年首次报道在植物中表达菌毛多肽。Shin等[62]克隆FimA蛋白的C-末端氨基酸残基266～337的编码基因，然后插入到植物的表达载体中编码CTB（霍乱毒素B亚单位）的基因片段的下游，然后此嵌合性载体ctb-fimA被转染到马铃薯（Solanum tuberosum）细胞中表达蛋白。通过ELISA对CTB-FimA融合蛋白的定量分析表明，此蛋白占全部可溶性蛋白的0.33%，表达量较低，尚需要进一步改进。

国内刘鲁川[63]1994年首先以pUC13Bg12.1质粒为模板，PCR扩增fimA基因部分片段（504～1045 bp，总扩增长度为542 bp）。

郭红梅[64]2007年成功的构建了FimA蛋白与IL-15真核共表达质粒，以其作为DNA疫苗经滴鼻免疫Wistar大鼠，能够激发　机体产生特异性的系统免疫应答，又能激发粘膜免疫应答。疫苗所表达的IL-15可以作为辅助因子增强sIgA应答，对Pg引起的实验性牙周炎提供有效的保护，为解决增强sIgA应答来对牙周组织提供保护的难题提供思路。

2.4 有关大肠杆菌表达系统

2.4.1 大肠杆菌表达系统

大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统[65] 。大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分被人们了解，而且有大量可供选择的克隆载体与表达载体，已经成为表达许多异源蛋白质的首选表达系统[66，71]。大肠杆菌遗传图谱明确，容易培养且费用低，对许多蛋白质有很强的耐受能力，能高水平的表达这些蛋白质。但是，在实际工作中，常常需要使外源基因得到最佳的表达，以满足人们各种研究需要。此外，许多外源基因在大肠杆菌胞内表达时，往往不能自发折叠卷曲生成有一定空间结构的特定功能的蛋白质，而是以一种不溶性的沉淀即包涵体的形式存在于细胞内[67 ，68 ] 。包涵体的形成在某种程度上限制了大肠杆菌表达系统的应用。由于处于包涵体中的重组蛋白没有生物活性，为使重组蛋白具有生物活性，必须将包涵体复性，而包涵体的变性、复性一直困扰着许多科学工作者[69，70] 。

2.4.2 在大肠杆菌中表达外源蛋白的优化[71]

1）翻译效率的优化：启动

有效启动翻译需要起始密码上游的核糖体结合位点。翻译起始过程中，5～9个核苷酸长的Shine-Dalgarno序列与16S RNA的3'末端发生作用。Shine-Dalgarno序列与起始密码ATG之间的距离对翻译效率有影响，在ATG下游插入开放阅读框架的载体，此段距离已经优化，如果克隆基因以自身的ATG起始翻译，起始密码应位于Shine-Dalgarno序列下游5～7个核苷酸。

翻译起始区的二级结构也影响基因表达效率。Chen等通过改变Shine-Dalgarno序列上、下游的核苷酸，减少二级结构的形成，提高了基因表达水平。与此类似，也有一些基因通过共翻译，也就是在一段翻译序列的下游插入目的基因编码序列，提高了表达水平。

2）密码子的使用

遗传密码与氨基酸并不是一对一的关系，61种密码子编码20种氨基酸，而其中只有两种是由单一密码子编码的，其余的18种中的每一种都有多个密码子，编码同一种氨基酸的不同密码子的使用频率也是不同的。

如果编码区中有大量的或成串儿的稀有密码子，通过突变或基因重合成去除这些稀有密码子，可以提高表达水平。另外，如果靶序列中有稀有密码子AGA或AGG，会带来一些特殊问题，因为它们在编码区内部又形成额外的Shine-Dalgarno序列。

编码外源蛋白氨基酸的序列对表达水平也有很大影响。因此有必要用聚合酶链反应（PCR）或定点突变的方法，把表达基因N端的7～8个密码子变成大肠杆菌中最常用的密码子。还应尽可能通过这些方法将靶基因5'端（G+C）含量降至40％以下。

3）培养条件优化

在表达系统相同的情况下，不同的培养基常导致表达水平的巨大差异。LB类标准培养基可以用于建立表达的基本参数，但只有对培养条件进行优化后，才能获得最佳表达，包括使用基本盐培养基，如M9，限定盐培养基，如诱导培养基，或丰富培养基，如肉汤、YT或NZCYM。

一些培养基添加剂能提高某一种特定蛋白的表达水平。这其中包括浓度在0.1～0.5 mol/L之间的NaCl、不可代谢糖如蔗糖（0.2～0.6 mol/L）、辅助因子（血红素）和抗生素。Lee和Beckwith注意到，分泌途径缺陷的抑制基因位于与蛋白质合成有关的基因上，这些抑制突变的最终效果是降低蛋白合成速率，而低浓度抗生素能在大肠杆菌中模拟它的作用。表达外源蛋白尤其是分泌蛋白时，在培养基中加入抗生素，如氯霉素（1 μg/ml）和四环素（0.1 μg/ml），能降低蛋白合成速率，防止分泌系统过载，分泌蛋白也就更容易与伴侣分子等结合，折叠成天然构象。最后，培养基的pH也能影响外源蛋白的表达，当LB培养基的pH降至5.5以下时，可溶性的α-葡萄糖苷酶的表达量显著提高。极端pH可能会使细胞生长速率降低，从而防止细菌表达/加工系统过载。

在克隆基因的上游插入强的可调节启动子和有效的核糖体结合位点，可以在细菌中表达非融合蛋白。融合蛋白能大量制备，易于纯化，而且能赋予蛋白新的免疫学或生物学分析反应特性。

2.5 六聚组氨酸融合蛋白的纯化

近年来，随着蛋白质组学研究的发展，基因工程重组蛋白的分离纯化技术显得尤为重要，要将目标蛋白从复杂样品中快速、特异地纯化出来，就需要选择合适的蛋白纯化方法。

融合标签技术是20世纪末兴起的一种基于报告基因的重组DNA技术。融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便，并很快得到了应用。目前常用的蛋白纯化标签是GST（谷胱甘肽巯基转移酶），6×His（六聚组氨酸）和表位标签（如FLAG是专为蛋白纯化和检测设计的八肽，HA是流感病毒血凝素表位等），其中6×His最为常用，带有6×His标签的融合蛋白可利用固定化金属鳌合亲和层析和免疫亲和法进行纯化。

Porath于1975年首次提出固定化金属螯合亲和层析(IMAC)的概念[72]，该法基于蛋白质表面的组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等残基与固定化金属离子的相互作用而对蛋白质进行分离纯化。其中，组氨酸是与金属离子作用较强的氨基酸，含有多个组氨酸的蛋白质可在IMAC中有效保留，故人为设计的多聚组氨酸便成为最常用的蛋白质纯化标签[73]。

免疫亲和纯化是一种利用抗原抗体特异性可逆结合特性的技术，它具有高效、高收率、浓缩效应等优点。在众多蛋白质纯化技术中，免疫亲和纯化是十分关键的技术。标签融合蛋白可通过抗标签的单克隆抗体和多克隆抗体来纯化。多数免疫亲和纯化都使用单克隆抗体，但有两种类型的多克隆抗体可用于免疫亲和纯化，即针对合成肽(如6×His、FLAG标签等)或某种抗原的特定区域产生的抗体。在这两种情况下，由于结合到固定化抗体上的抗原位点局限在一个很小的区域，因此可实现有效的洗脱。目前已有商品化的特异性针对标签的单克隆抗体，但价格都比较昂贵。

重组蛋白在大肠杆菌（E. coli）高效表达时，往往以不溶的、无活性的蛋白聚集体，即包涵体(inclusion body)的形式存在于细胞内。必须从细胞内分离出包涵体，采用高浓度变性剂（如7.0 mol/L盐酸胍、8.0 mol/L脲）溶解包涵体，然后除去变性剂或降低变性剂的浓度，使包涵体蛋白得以复性，最后再用色谱法使目标蛋白质得到纯化。其中包涵体蛋白的复性和纯化是整个过程中的核心。

2.5.1 融合标签技术

1）融合标签技术

融合标签技术是20世纪末兴起的一种基于报告基因的重组DNA技术，其主要过程是利用重组DNA技术在靶蛋白编码基因的3'端或5'端融合某种标签的编码基因，通过适宜的宿主来表达重组蛋白质[74-78]，表达的重组蛋白质可以通过融合的标签与包被在固相基质上的特异配基结合而进行纯化。融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便。近几年，随着新的融合标签系统的开发，其功能逐渐多样化，除用于蛋白质纯化外，还用于蛋白质定位和检测等。

2）融合标签的种类

融合标签根据其分子量大小可分为两大类:大的蛋白质分子(或蛋白质结构域及其衍生物)和小的多肽片段。大的蛋白质标签有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)、SPA(葡萄球菌蛋白A)和GFP(绿色荧光蛋白)等，它的使用会增加目标蛋白的溶解性，但在蛋白结晶和抗体产生等过程中，标签必须去除。小的多肽标签有6×His(六聚组氨酸)、HA(流感病毒血凝素表位)、c-myc(人c-myc蛋白表位)、FLAG(专为蛋白纯化和检测设计的八肽)等，多数情况下，由于多肽标签相对较小，对融合蛋白质结构影响小，不需要从融合蛋白质中切除，因而多肽标签较蛋白质标签更为常用。迄今为止，己有文献较为详尽地报道了各种融合标签[79，80]，其大小从几个氨基酸到蛋白质不等，相互作用类型包括酶与底物、细菌受体与血清蛋白、六聚组氨酸与金属离子、抗原与抗体等[81]。

3）融合标签技术用于蛋白的纯化

融合标签技术用于重组蛋白质纯化已为大量实验所证实[82-86]。理论上，根据亲和纯化原理可定向设计使目标蛋白质与纯化基质之间不发生任何直接相互作用的融合标签，以避免由于这种直接相互作用造成蛋白质变性。目前已有许多不同的标签可供利用。它们利用了标签与固相配体间的相互作用，从而可从复杂的提取物中对标签融合蛋白进行选择性的结合和洗脱。目前常用的蛋白纯化标签是GST，His和表位标签。

最常用的标签是His标签，即多聚组氨酸。该标签由6～10个连续组氨酸组成，置于蛋白的氨基或羧基末端。His标签与其他标签相比有很多明显优势：①对金属离子如镍、钴有高度的选择性和亲和力[87]；②与金属离子的结合不受变性剂(尿素、胍)的影响；③温和多样的洗脱条件(100～250 mmol/L咪唑，低pH，10 mmol/L EDTA)。目前已有各种商品化介质(Ni-NTA-Agarose，Ni-IDA-Agarose)提供。另外，抗His标签的单抗或多抗也被应用于His融合蛋白的纯化。

GST标签是用来从细菌表达系统中纯化蛋白较为成功的标签之一。在该系统中，GST与被标记的蛋白进行融合，融合后的蛋白可在许多表达系统中表达。GST和谷胱甘肽紧密结合，融合蛋白可通过谷胱甘肽固相柱纯化，洗脱未结合的蛋白后，结合蛋白可用含游离的谷胱甘肽缓冲液进行洗脱。该系统中被融合的目标蛋白常可正确的折叠成为有功能的区域，故十分有用。该系统的另一个优势是可快速、温和地纯化，且配体谷胱甘肽的成本较低。

表位标签(HA、c－myc和FLAG等)也已广泛用于融合蛋白的纯化研究。目前已有商品化针对表位标签的单克隆抗体。为使标签在纯化中发挥良好的作用，在纯化过程中应尽量避免使用剧烈的条件使抗体和标签之间解离，剧烈的条件可使抗原发生不可逆变性，目标蛋白的回收率低。用游离多肽竞争洗脱法洗脱结合在固相抗体上的标签融合蛋白，是优选的方法。

4）融合标签技术在其他领域的应用

融合标签可提高重组蛋白的产量，由于外源蛋白质对于宿主菌的异质性，当外源蛋白质在宿主菌内表达时，宿主菌会调动各种机制来阻止外源蛋白质过量表达，导致的直接后果就是我们所需要的目标蛋白质表达量降低。近几年的研究发现，当外源蛋白质融合某些特定的标签后，能够有效增加重组蛋白质的产量[88-90]。

融合标签还可增强重组蛋白质的可溶性，外源蛋白质在宿主菌内表达时大多以包涵体形式存在[91]，致使很难获得大量有活性的天然蛋白质。为了防止包涵体形成，一般可以采用低温诱导表达蛋白质，但这种方法并非对所有蛋白质都有效。研究发现，一些高度可溶的蛋白质在与其他蛋白质融合后会促进融合蛋白质以可溶形式表达，如MBP等[92，93]。

2.5.2 金属螯合亲和层析技术

1）金属螯合亲和层析技术的发展

1948年，Hearon发现水溶液中组氨酸和半胱氨酸可与Cu2+，Zn2+形成稳定的复合物。研究还发现，固定在凝胶上的金属离子Cu2+或Zn2+可与蛋白质表面裸露有咪唑基或巯基的氨基酸残基结合。因此，含有金属离子Cu2+或Zn2+的凝胶可用来选择性吸附表面含有组氨酸或半胱氨酸的多肽或蛋白质。

1961年，Hellferich提出以固定于载体的金属离子来分离小分子的概念，称为配基交换层析(ligand exchange chromatography，LEC)[94，95]。

1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography，IMAC)”的概念[72]，首次成功地在琼脂糖凝胶上偶联了螯合配基亚氨基二乙酸(IDA)。IDA与金属离子如Cu2+螯合后，可与蛋白质结合，不同组成的蛋白质与金属离子结合力不同，据此将蛋白质进行分离。最常用的金属离子包括Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡态金属离子。不同蛋白质分子内的组氨酸、半胱氨酸以及色氨酸等残基种类、数量、位置和空间构象不同，因而与金属配基的亲和力大小不同，从而可选择性地加以分离纯化。

1987年，Hochuli等[96]在目标蛋白质末端接上六聚组氨酸多肽得到纯化的重组蛋白质。此后六个组氨酸标签广泛应用于重组蛋白质的纯化。近年来，原核生物表达的重组蛋白质已有50%以上都是通过末端接有六聚组氨酸多肽而被纯化出来[97]。

目前，固定化金属螯合亲和层析技术已成为蛋白质，特别是基因重组蛋白和多肽分离纯化最有效的工具之一。

2）金属螯合亲和层析作用原理

固定化金属螯合亲和层析基于蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子的亲和力不同对蛋白质进行分离。金属螯合亲和介质与蛋白质的作用如图2.1所示。过渡态金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，在溶液中被水分子或阴离子占据。当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时，氨基酸残基的供电原子(如组氨酸残基的N原子、半胱氨酸残基的S原子)将取代与金属离子结合的水分子或阴离子，与金属离子形成复合物，从而使蛋白质分子结合在固相介质表面。氨基酸中的α-氨基和α-羧基，以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原子都能参与螯合反应，由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同，因而与金属配基的亲和力大小不同，从而可选择性地加以分离纯化[98]。

图2.1 金属螯合亲和介质与蛋白质的作用

生物分子与金属离子间的结合强度与它们的轨道重叠程度有关，结合作用可分为三种[99-100]：

（1）静电吸引：修饰后的基质带有净负电荷，它可吸附分离表面氨基酸残基带正电荷的蛋白质。

（2）配位键结合：蛋白质表面的组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等残基上有咪唑基、吲哚基、巯基等，其氮原子、硫原子上未共用电子对与固定化金属离子形成配位键。

（3）共价键结合：固定化金属离子与蛋白质表面含硫基团作用形成共价键。

蛋白质与金属离子亲和力不同可用Pearson的软硬酸碱理论来解释[101]。该理论认为两个原子相互作用成键时，其中一个原子作为路易斯酸，另一个作为路易斯碱。根据软硬酸碱理论，金属离子如K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+属于硬酸；单价金属离子如Ag+、Cu+归类为软酸；过渡态金属离子如Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+属于中间酸。相应的，与金属离子结合的配基如氨基酸或蛋白质可分为三类碱，其中含氧原子(如羧基)、脂肪族的氮原子(如天冬氨酸和谷氨酸)和磷原子(如磷酸化的氨基酸)的配基属于硬碱；含硫原子(如半胱氨酸)的配基属于软碱；含芳香族氮原子(如组氨酸、色氨酸)的配基属于中间碱。中间酸Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+可与含芳香族氮原子(如组氨酸、色氨酸)的中间碱以及半胱氨酸结合。由于蛋白质表面裸露氨基酸中半胱氨酸极少，因此组氨酸残基是与过渡态金属离子结合的主要基团[102]。

六聚组氨酸融合蛋白在金属螯合亲和层析介质表面结合和解离流程如下：

（1）将螯合配基以共价结合的方式固定在固相载体上。

（2）加入含有金属离子如Co2+、Ni2+的溶液，金属离子会与螯合配基形成配位键而固定在固相载体上。

（3）加入含有六聚组氨酸融合蛋白的溶液或发酵液，使六聚组氨酸融合蛋白与金属离子间以配位键方式结合在固相载体上，而与金属离子没有作用力的蛋白被分离出去。

（4）洗脱结合在固相载体上的六聚组氨酸融合蛋白。对金属螯合亲和层析介质上所结合的六聚组氨酸融合蛋白常用pH值(pH 4～5)或含咪唑的溶液进行洗脱，低pH可减弱蛋白和金属离子的相互作用，使六聚组氨酸融合蛋白得以洗脱，而咪唑是竞争性取代剂，可置换结合在介质上的六聚组氨酸融合蛋白，较低的pH和咪唑互相配合可更好地使六聚组氨酸融合蛋白被洗脱[103]。

3）金属离子的选择

金属离子的配位数直接影响其与螯合配基及生物分子的结合，配位数既要保证能与螯合配基形成稳定的化合物，又要保证有剩余的位点与目标蛋白的氨基酸残基结合。由于金属离子所带电荷、离子半径等不同，对蛋白质呈现不同亲和力，目前常用金属离子有Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+等，它们具有相同电荷，离子半径分别为69、72、74和74pm。半径越小，配位作用越强，与蛋白质形成的络合物越稳定。因此，Cu2+对蛋白质结合力最强，Ni2+次之，Co2+和Zn2+结合相对较弱[104]。

4）金属螯合亲和层析用于生物分离纯化

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[中图分类号]R714.21 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（c）-0101-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the dynamic changes of β-HCG， P， sHLA-G and pregnancy outcome. Methods Patients with threatened abortion and tocolytic treatment in Changsha Maternal and Child Health Care Hospital （"our hospital" for short） from July to December 2015 were selected as experimental objects. During the course of treatment， 34 cases of spontaneous abortion were set as abortion group， and 106 cases of pregnancy were set as pregnancy group. At the same time， 50 cases of pregnancy women for regular routine inspection in our hospital were selected as control group. Serum sHLA-G changes were measured quantitatively by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） at 5 to 10 weeks of gestation. Serum β-HCG and P Levels were detected by chemiluminescence method. Results Serum sHLA-G levels of pregnant women from 5 to 10 weeks among three groups were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum sHLA-G levels of pregnant women from 5 to 10 weeks in abortion group and pregnancy group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum β-HCG levels of pregnant women from 5 to 10 weeks among three groups were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum β-HCG levels of pregnant women at 7， 8， 10 weeks between control group and pregnant group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum β-HCG levels of pregnant women from 7 to 10 weeks between abortion group and pregnant group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum P levels of pregnant women from 5 to 10 weeks among three groups were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum P levels of pregnant women from 7 to 8 weeks between control group and pregnant group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum P levels of pregnant women from 7 to 10 weeks between abortion group and pregnant group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion sHLA-G combined with β-HCG and progesterone as the preadictors of threatened abortion outcome can improve the accuracy of prediction and reduce unnecessary treatment， it is spefic for sHLA-G to distinguish the pregnancy outcome of threatened abortion in early pregnancy of 5， 6 weeks.

[Key words] Threatened abortion； sHLA-G； Outcome prediction

先兆流产是孕期常见的临床病症之一，占全部妊娠的10%～15%[1]。妊娠早期通过检测相关因子来预测其发展为不良妊娠的风险，可减少不必要的保胎治疗，减轻患者心理负担。大量研究显示，先兆流产患者体内β血清人绒毛膜促性腺激素（β-HCG）、孕激素（P）、血清可溶性人类白细胞抗原G（sHLA-G）水平会发生变化[2-4]，本文通过联合动态检测β-HCG、P、sHLA-G变化来研究其对先兆流产结局的预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年7～12月就诊于长沙市妇幼保健院（以下简称“我院”）并要求保胎的先兆流产患者140例，年龄20～35岁，平均年龄（24±5）岁，孕龄5～8周，平均（6.56±1.60）周。治疗过程中自然流产者34例设为流产组；继续妊娠者106例为妊娠组；选择同期在我院定期常规产检的50例正常妊娠孕妇为对照组，年龄20～35岁，平均（23±4）岁，孕龄5～12周，平均（6.83±1.50）周。三组孕妇的一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。孕龄的确定依照孕妇的末次月经及经阴道超声测胎儿头臀长度计算。

1.2 纳入标准

①病史：停经5～12周。②症状：血性白带甚至阴道流血，数小时至数天后有或无下腹胀痛、腰骶部坠痛、酸胀等不适。③妇科体征：宫颈口闭合、未见妊娠物排出，子宫大小与孕妇停经周数相符合。④辅助检查：B超示子宫内见孕囊，有或无胚胎存及心脏搏动；尿妊娠试验阳性。

1.3 排除标准

①双胎；②保胎治愈组患者孕12周内再次出现先兆流产症状或住院期间孕龄6～10周血sHLA-G、P、β-HCG值未连续监测者；③入院后未经治疗即明确诊断为不良妊娠者；④排除夫妻双方染色体异常、孕妇糖尿病等慢性疾病及免疫性、解剖及感染性因素。

1.4 研究方法

1.4.1 仪器及方法 治疗前及治疗期间每4天分别抽取两管静脉血，每管4 mL，4000 r/min离心，留置血清，一管置于2～8℃冰箱中保存，采用化学发光法检测β-HCG及孕酮水平，另一管置于-80℃冰箱中储存至检测，采用双抗体夹心法检测sHLA-G，试剂盒来自上海史瑞可生物有限公司；采用酶标仪（美国550型BIO-RAD）测定吸光度，波长为450 nm，所测为血清总sHLA-G水平。

1.4.2 治疗方案 HCG 2000 IU肌内注射，一日两次，黄体酮20 mg肌内注射，一日一次，至阴道流血停止3 d后为止。治疗期间B超确诊为胚胎停育或流产者终止保胎治疗。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两样本均数比较采用t检验，多样本均数比较采用方差分析，计数资料采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组孕妇不同孕龄时间血清sHLA-G水平比较

三组孕妇孕5～10周血清sHLA-G水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；对照组与妊娠组孕5～10周血清sHLA-G水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；流产组与妊娠组孕5～10周血清sHLA-G水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；三组孕妇血清sHLA-G的95%参考值范围不同，且不存在交叉范围。见表1。

2.2 三组孕妇不同孕g时间血清β-HCG水平比较

三组孕妇孕5～10周血清β-HCG水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；对照组与妊娠组孕7、8、10周血清β-HCG水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；流产组与妊娠组孕7～10周血β-HCG水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 三组孕妇不同孕龄时间血清孕酮水平比较

三组孕妇孕5～10周血清孕酮水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；对照组与妊娠组孕7～8周血清孕酮水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；流产组与妊娠组孕7～10周血清孕酮水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

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对此，荷宝基金首席分析师陆敏在接受《中国联合商报》记者采访时分析：“这意味着上海白猫股份，已经站在了生与死的十字路口。他们目前只有或者重组成功或者暂停上市甚至退市两种选择。”

难解的亏损困惑

根据上海白猫股份年报披露的数据，上海白猫股份2008年实现主营业务收入34895.31万元，同比略升1.18％；受外部环境影响，实现主营业务利润2709.51万元，同比下降28.31%。扣除销售费用近5000万元、管理费用3400多万元、财务费用300多万元等，白猫的净利润为-3500多万元，每股收益为-0.234元。

“大家都在把亏损归咎于去年爆发的金融危机，可我们在国际贸易上是赢利的，不知问题到底出在哪了。”上海白猫股份国际贸易部一负责人，在接受《中国联合商报》记者采访时说道。

对此，上海白猫股份董事长办公室一负责人陆梅向《中国联合商报》记者进行了解释：“我们在去年的外贸销售收入同比上升了24.78％，但受人民币汇率上升的影响，销售利润却同比减少1224.21万元；再加上前年下半年国家开始调整牙膏出口退税率，也使我们外贸销售利润同比减少539.97万元。”

“这些都是大家共同面临的外部大环境，白猫股份之所以连年出现亏损。我认为最重要的是在国内牙膏产品销售异常激烈的情况下，白猫股份由于重组不畅导致投入不足，以致影响了它的市场营销和拓展进度。”中投证券上海营业部投资经理戴克江向《中国联合商报》记者如此表示。

一波三折的重组

对于上海白猫股份的处境。业内人士分析，必须依靠大股东的力量才能走出来。但在事关重组的大问题上，上海白猫股份的大股东浙江新洲集团的表现让人很是摸不透。“我们的管理层也一直在积极配合、督促大股东推进资产重组工作，可自从去年4月28日出台了一个重组方案后就一直进展不顺。现在更是没有任何动静和进展。”陆梅带点抱怨的口气向《中国联合商报》记者说。

根据陆梅的说法，在2008年4月28日和5月9日，他们曾联合第一大股东新洲集团对上海白猫股份做了一个重大资产重组的公告。公告的大体内容是新洲集团将下属房地产公司股权与白猫股份的全部资产、负债进行置换，置换完成后，白猫股份转型为房地产开发企业。

而在《中国联合商报》记者致电新洲集团总裁办公室询问时。一个姓王的负责人也表示：“现在还没有任何关于重组这方面的新消息。具体的部署也还没听说。”不过谈起这个重组方案姓王的负责人承认有这个事。“为了此次资产置换，我们还在上海普陀区全资设立了上海威顺投资管理有限公司，用于购买新洲集团拥有上海白猫股份的股权，再将白猫股份全部资产和负债划进来。”

新洲集团在当时也承诺，“在注入两家地产公司进入白猫股份后，新洲集团将不再从事新的房地产业务以解决同业竞争的问题。”

没有选择的选择

那么面对连年亏损和重组的缓慢，上海白猫股份到底是选择重组成功还是暂停上市甚至退市，恐怕已经没有多少时间来进行思考了。

“上海白猫股份是国企，在日用领域尤其是牙膏方面是中国的一面旗帜。因此是不可能轻易退市的。剩下的就只有一条路可选了那就是重组。”陆敏向《中国联合商报》记者解释。

事实上，这几年上海白猫股份也一直为避免退市而挣扎着。如在2005年白猫股份在净利润为-701万元的情况下，才引入了新洲集团。

对此说法，王立欣表示认同。“当然如果能够扭亏为盈更好了。但截止上海白猫股份到今天的表现，这种可能性的发生有很大的难度。”

相关资料也显示，此前的2007年，白猫股份亏损了925.2万元。而今年则是3500万元。显然，白猫股份的经营情况非但没有好转，而且呈现出加速滑向泥潭的趋势。然而，白猫股份的资产置换方案至今尚无明显的进展。

“我认为不排除改变把上海白猫股份变为房地产公司的重组计划，毕竟作为上海白猫的第一大股东，新洲集团此前一直没有过经营日化行业的背景，而且从新洲集团进入上海白猫股份的作为看，也并没止住上海白猫股份继续下滑的势头。”戴克江向《中国联合商报》记者分析。

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比如李嘉诚在内地保健品领域，就拥有不小的话语权。

羊胎素、有机奶粉、专供孕妇食用的 DHA产品，以及某些内地学生逢大考前常常吃的保健品，都有李嘉诚的产业。准确地说，这些产业都归拢在和记黄埔旗下的和黄健宝保健品有限公司，这家公司成立已超过10年。

求医问药时，有些常用药，比如板蓝根颗粒、复方丹参片，也有李嘉诚的影子。

和记黄埔旗下有专门的医药科技公司，在医药行业是不折不扣的“隐形大户”，势力覆盖“北上广”李嘉诚在北京与同仁堂合作，在上海开办有上海和黄医药有限公司，在广州与白云山医药合资建厂。

2004年时，李嘉诚明确定调：中药将是和记黄埔的第六大支柱产业。紧跟着在2006年，李嘉诚就将他的医药公司名单，挂上了欧洲的伦敦交易所，成了笔跨国大生意。 2011年5月20日，香港，李嘉诚在公司股东会后出席新闻会。

另外一个巨头雀巢公司就看中了李嘉诚在中药产业上的判断，更看中李嘉诚在中药行业隐秘深耕多年的家底：和记黄埔的中药材库十分巨大，包括1200多种药用植物的5万种提取物。去年年底，雀巢第一次涉足中药产业在此之前，这家瑞士公司也确实在尝试做一些实验，比如在婴儿米粉中加入绿豆和莲子，让产品能“去火”。

雀巢现在与李嘉诚合伙开办了一家公司，希望可以找到用中药治疗肠胃病的办法。

总之，热衷于进入医药行业，这一点李嘉诚与比尔·盖茨的投资兴趣很像。

除此之外，一个日化品牌白猫洗洁精，从2006年开始，就已经是李嘉诚的无形资产。2006年和记黄埔收购了白猫集团所持有的上海白猫有限公司80%的股份，共同组建上海和黄白猫有限公司，也就是“和黄白猫”。2009年4月，白猫集团又将“白猫”商标转给和黄白猫，所以在市场上看到的“白猫”洗涤产品，已经盖上了李嘉诚的烙印。

需要说明的是，“白猫”其实有两个，另一个“白猫”是白猫股份，是一家经营不善的上市公司，2010年已退市。其间两只“白猫”乌龙不断，引得和记黄埔的新闻发言人要不时澄清：这只白猫和李嘉诚没关系。

李嘉诚在另一个时髦领域互联网、IT行业的投资令人感觉距离感更小。

他投过facebook、skype，以及后来被苹果公司买走的语音助手软件Siri。投facebook的决策时间只花了五分钟，而当时的facebook尚未营收。五年间，他手中所持的3%股权，回报率高达580%，据估计，他能从中赚得20多亿美元。李嘉诚却表示，在自己投资的新科技公司中，facebook赚得未必最多。

为他物色高科技企业的公司叫维港投资，专注于中早期科技类项目其操盘者正是五分钟内说服李投facebook的周凯旋。据《经济观察报》报道，维港投资团队成员只有四名，一贯低调，没有官方网站，却能凭其遍布全球的团队，挖掘出一般人不易察觉的项目。

再往近了说，我们的“衣食住行”，也有“李嘉诚牌。”华南地区能吃到的东北大米，会有一部分来自和记黄埔在黑龙江的生产基地。《证券时报》曾经报道说，在中国入世前，李嘉诚受邀到黑龙江投资稻米，并于1998年成立合资企业，开发近150万平方公里产粮地。

篇7

1998年，埃米尔·库斯图里卡导演的作品《黑猫白猫》一经推出便备受瞩目。似乎总是不修边幅的人物形象，粗粝而又充满想象力的画面，浓烈的影像色彩，铺天盖地的戏谑、玩笑、嘲弄和寻欢作乐，毫不吝啬的语言对白，此起彼伏的喧闹场景，喜剧化的故事结局——在这些库氏影片的惯常“癫狂笑闹”影像风格背后，也隐藏着库斯图里卡惯常的某些观念和情愫。而对该片不同年龄层人群的划分和形象设定的解读分析，正是我们深入探寻导演观念和情愫的最佳途径。

一

《黑猫白猫》片中的人群，可以按照年龄层划分为三个明显的人群——老人、孩子和中年人。每一个年龄层人群，总有着对应的人物性格和形象。

电影中的两个老头子：吉普赛黑帮教父格加和他的老友扎吉，还有个吉普赛大妈，性格是如此地相像——和蔼开明、关爱孙辈、而又有些孩子气的老顽童。

格加最喜欢重复观看《卡萨布兰卡》的结局部分，并重复那句经典的台词“路易，我想这是一段美好友谊的开始”。在影片最后，看着扎吉的孙子扎拉和爱人艾达在多瑙河上完成婚礼并登上游船后，他和扎拉一边干杯一边再次念出这句台词——和阁楼上这两位老友被“死后”冰封又同时“复活”的奇妙经历结合起来，这句经典台词和他们手中的美酒，真正成为两人几十年友谊的最佳象征。

在家庭内部，这三位老人最为关心的就是自己的孙辈。格加一次又一次劝说长孙葛尔加结婚。扎吉为了孙子特意把所有积蓄都藏在手风琴里并最终念念不忘地亲手交给了他，甚至愿意以自我牺牲来阻止孙子将要被迫进行的不幸婚礼。艾达的吉普赛祖母从一开始想把孙女艾达卖给黑帮头子达旦做老婆，到后来接受了孙女对爱情的选择。三位老人对于家庭后代的关爱，与后面将要提到的中年人一代形成了讽刺性的鲜明对比。

影片中的几个孩子——扎拉、艾达、葛尔加以及达旦的妹妹“小瓢虫”，都是执拗而可爱的，都有着对爱情的坚持。他们身上所展现的正是青春的张扬和对爱情的忠贞。经过挣扎、反抗与坚持，扎拉和艾达、葛尔加和“小瓢虫”这两对有情人终成眷属，这是库斯图里卡对于这种青春的真善美的肯定和赞美。

反观影片中的中年人一代，其代表就是财迷心窍、胆小懦弱的马考以及其暴戾蛮横、欺软怕硬的“好友”——自称“商人和爱国者”的黑帮匪徒头子达旦，以及那个道貌岸然的政府证婚官员。

马考一直觊觎父亲的工厂和财产，并且妄想通过侵吞国家物资来大发不义之财；而流氓成性的达旦则对“好友”马考的发财计划来了个杀人吞赃，甚至对马考一顿毒打。为了金钱利益，他们合计着分别出卖了自己的儿子和妹妹的婚姻幸福。由于格加和扎吉两位长辈先后突然“猝死”会打断婚礼，两人不顾一切地将两位老人的“尸身”冰冻起来--从这对中年“老友”身上，观众只能看到荒诞不经、财迷心窍、尔虞我诈以及对家庭成员的漠视和利用。和他们长辈的交情相比，他们之间的“友情”是何其的荒诞与讽刺。

而那位西装革履的证婚官员，他摔开的皮箱里除了文件外还赫然滚落出各种吸毒工具——瘾君子的事实将他冠冕堂皇的脸皮在众人面前瞬间揭穿。而为了保住颜面，他居然还向同为瘾君子的达旦结结巴巴地辩解和哀求。这种戏剧化效果带来的讽刺真可谓酣畅淋漓。

二

通过对人物群体的划分，片中老人、孩子和中年人这三组人群迥异的形象得以分别展现。而导演如此划分人群并设定群体形象的动机，就需要进一步解读了。

从库斯图里卡的电影作品特征来看，狂欢、家庭、乡愁、音乐、黑色幽默和政治讽喻这几大元素可谓旗帜鲜明。尤其是政治讽喻这一重要元素，在其青年时代的电影创作中就已初现端倪。而在他被迫远离南斯拉夫长期旅居西欧的二十世纪九十年代期间，南斯拉夫已经处在战乱频繁、分崩离析的阶段。库斯图里卡电影作品中的乡愁和政治讽喻元素，在无形中产生融合并显得更为浓重。如果说1995年推出的《地下》淋漓尽致地展现了这种融合的话，那么《黑猫白猫》则是在另外一种视角的小范围故事框架内，含蓄地将这种融合潜藏了起来。这些因素便是对本片群体形象进行解读的关键症结所在。

从二战爆发到整个冷战时期的几十年时间里，无论是面对纳粹德国还是苏联，南斯拉夫一直是一个敢于抗争、从不屈服的国家。而《黑猫白猫》中所塑造的年轻人群体形象，同样是勇于坚持、敢于抗争的，这可以视作是南斯拉夫几十年来国家不屈形象的人形化表现。通过对影片中年轻人们最终争取到自由和幸福命运的歌颂与赞美，库斯图里卡也完成了对故国南斯拉夫的致敬。

对于影片中的老人群体，库斯图里卡对他们也持着一种肯定和赞美的态度。他们对孙辈的关爱和付出、甚至是自我牺牲，其实也象征着真正的爱国者对于南斯拉夫这个国家的真正关爱--不仅是关心孩子和国家的现在，也关心孩子和国家的未来。作为一个电影艺术家，库斯图里卡多少也把自己对故国南斯拉夫的热爱之情，通过片中老人们这个群体加以抒发。

相对的，影片中的中年人形象也是库斯图里卡用意最深的部分——这些财迷心窍、好赌滥饮、道貌岸然的投机犯、瘾君子和伪君子们，他们本应是家庭的主心骨、国家的中坚力量。但是在影片中，他们的形象却是如此不堪入目。可以说，库斯图里卡所塑造的这些中年人的形象，正反映了他对于搞垮南斯拉夫的那批蛀虫的痛恨和不齿。如此塑造这两个中年人的形象，就是对造成南斯拉夫动乱分裂的那些罪魁祸首的一种讽喻。

同时我们也可以发现，影片中的老人群体对这些中年人群体往往持有一种怀疑甚至是厌恶的态度——扎吉更喜欢懂事的孙子扎加而不是儿子马考，格加并不待见上门借钱的马考并拔枪警告他，格加面对达旦时的那种轻蔑态度……可以说导演借助片中老人群体对中年人群体态度的设定，抒发着自身对于片中中年人群体所象征的现实人群的憎恶情感。

篇8

话剧开始了，出现了独眼狼、单眼狼，他们被关进大牢里，外面有很多士兵守卫。就在这个时候，臭狐狸代表大灰狼来看他们。它手里拿着一盒曲奇饼干，说：“我特意代表大灰狼来看你们了，这盒饼干是我们的一点心意。当年大灰狼和你们一起坐牢，可是被一场海啸分开了，这次我们找到了你们，特意送来饼干，表示一点心意……”

狐狸走了，卫兵也走了。独眼狼和单眼狼食偷偷地把曲奇饼干盒打开，他们发现盒子里面有一个纸条和一把万能钥匙，他们说：“这一定是大狼给我们的。”然后他们说，这两天一定会来一场大大的雷阵雨，所以要它们趁雷阵雨和雾气很大时把门偷偷打开，逃出去。

当然，这个计划成功了。半路上，突然听到黑猫警长的声音，他们拼命的逃，逃到了一家超市店门口，因为今天有雷雨，超市提前关门。他们突然想起自己手中有一把万能钥匙，他们就用万能钥匙把门打开，进入超市偷走了很多东西，把肚子也填饱饱的了。

可当出来的时候，发现黑猫警长把他们包围了。这时，大狼和狐狸从四周杀来救他们，于时他们冲出了包围。坏蛋们一起逃啊逃啊，突然发现黑猫警长在前面拦住了他们，白猫警长和小鹿警官在后面拦住了他们，使他们无路可逃，又被关进了大牢。

篇9

这三节课的共同点是：

一、基本上都落实了学讲计划的精神，先学后教，给足了学生自主学习的时间，整个教学过程中渗透了学生的自学、互学，教学的痕迹。突出了学生的主体地位，教师退到了后面，给足了学生充分展示自己的机会，教师主要发挥四两拨千斤的作用。

二、课堂教学有重点突出，教师对于教材的解读深刻，有新意，教学程序设计巧妙，环环相扣，条理清晰。教学过程中，重视对学生的朗读训练，形式多样，教师指导到位。

三、教师教态自然大方，在上课前都注重课堂管理，采用交谈，夸赞、鼓励性的话语拉近与学生的距离，让学生入情入境，充分调动学生的学习积极性，课堂气氛活跃。在教学过程中，教师语言亲切柔和，对学生的表现，评价及时中肯。

这三节课体现了三种不同的风格：

第一节宋颖老师执教的《桂花雨》，就如宋老师给人的春风化雨般的感觉一样，温柔舒适，亲切柔和，真有如沐春风般的感觉。尤其是指导朗读很有特色，善于创设情景让学生入情入境。在指导朗读赞美桂花之香时，创设了四种情景让学生读，当桂花落在额头、鼻尖、衣袖、全身不同的情况下对桂花的赞美。再如理解"缠"时，又创设了一天之内的不同时间"缠"着妈妈问啥时摇桂花的情景，让学生朗读体会。最动情的地方是配乐朗读和电影般的情景再现似回读。宋老师选的配乐曲温婉动听，听了确实令人动情，加之宋老师高超的朗诵水平，确实让学生直接的感受到了怀念故乡之情。宋老师还联系了最后一句中怀念儿时摇桂花的情景，运用配乐的方式回读文章的第三节摇桂花的句子，再现了这一情景，真如电影回放一样，听这节课令人很感动。

篇10

希望变成失望

山里到处是冰冷的空气。但清晨的阳光总能给人带来一丝的希望。可是我没有想到以后的路是这样艰难。 　今天的目标是碎石达板，不知为什么在大家的印象中翻过碎石达板就象征着即将到来的成功，剩余的路好象不再是路。

雪随着行进的脚步慢慢的越过脚腕，河道的冰层在太阳的照射下闪闪发光，一个浑然的天然冰场!我们感叹着。

董队、徐姐、王志和我选择了走山脊的路，大笨笨、飞砖、30、大臣、探路鱼、长白猫则选择了河谷，我们两队人马遥遥相应的在寒风中行进。

河谷中依稀地出现了点点的帐篷，心理开始纳闷这前面的也走的太快了，我们准备探个虚实。还未下到一半就见一人挥舞着双仗，原来是飞砖大声高喊，隐约中只听到博格达有暴风雪的字样，我的心刹时跌入了低谷之中，大家都知道暴风雪将意味着什么。

原来在此扎营的是另一队人马，昨晚已到这里，领队用很有经验的样子告诉我们博格达此刻正在暴风雪中，如果能上他们一大早就上了，这可是在拿生命开玩笑。 　当说到生命二字的时候大家的表情都很严肃，当面临选择的时候又该如何取舍。就在大家迷茫地作着思想斗争的时刻，董队坚决地说继续前进能不能上我们也得走到三号羊圈看了天气情况再定，就这样一句简短而坚决的话语重新坚定了大家已经快被瓦解了的信心。由于“大臣”早晨贪吃了“飞砖”的两个鸡蛋，胆囊炎发作只好跟随另队人马返回之外，其余的9人又踏上了新的征途。

前方的路越发模糊，风夹杂着地上的浮雪吹着大家红扑扑的小脸和大脸，可是没有一个人退缩，顶风而上迎来的是迷雾中的碎石达坂……

去不去大本营

小冰湖的雪比想象中的更深，恶劣的天气迫使我们不得不在小冰湖扎营。 　两个小时过去了，可是我们还未走出小冰湖，道路的艰难再一次出乎每个人的意料。是否去大本营成为大家争论的焦点。这个时候董队坚持，到了以肯奇达坂的脚下再做决定。夏天从这里往返大本营一小时的路程现在预计需要3小时。队伍慢慢的向前推移，行进的速度怎么都无法提起，12点我们才走到达坂脚下，这时候雪已经漫过膝盖，脚下的石头被雪覆盖了，无法预知下面的深浅和危险，一不留神就会陷入石头的夹缝中，扭伤脚腕，这是大家最最担心又最最害怕的。去大本营的提议已在这无声的行走中被 PASS，今天能否走出将军沟顺利返回到海西还是个大大的问号，敲打着每个人的心。但大家都很乐观的预测着翻上以肯奇达板后面的路会好的。 　夏日里的以肯奇达板现在已成为一座白雪皑皑的雪山，此时的博格达峰异常美丽，峰顶弥漫着白色的雾气，像在云中飘舞的仙子，大家为这美丽的景色惊叹着。

体力渐渐的不支，可达坂的顶一眼望不到头，上山的路越来越陡，探路鱼一马当先的在前面冲锋现阵，为大家开路，垂直距离简直无法行进，回家的感觉变得那么迫切。如果不能用我的双脚走上以肯奇达坂，那么我会用我的双膝爬上去。

我陷入窘境

我们用了整整四个小时登上了在夏天一个小时就可以翻过的达坂。前途变得未知而渺茫，已经4点了，想着今天不能赶回去明天的路依然未知，大家没有―点点翻过达坂面对胜利的感觉。达坂下的路并不乐观，雪甚至比上山的还厚，我真想卸下背包将它一脚踢下山崖，然后再把自己像个大皮球似的滚下去。夜好似也在赶路，看着渐渐下落的夕阳，所有的希望、所有的信念在这一刻都被瓦解。我拖着沉重的双脚机械的行走，雪套的链子开了，雪灌进了鞋子，双脚渐渐地冰凉。我已无暇顾及依旧行走，我告诉自己不能停，如果停下来我就会变成雪人留在这里，不能回家。

我想回家!

天已黑了，我的双手已经冻得失去了知觉，左手肿得像块面包，右手已经麻木。“如果不介意就把双手放进我的怀里，”30说。在这个冰天雪地，前不着村后不着店的地方，我还能介意什么，在这个时刻我还能在去考虑什么，所剩的只是一面之缘的感动。

在30温暖的胸怀中我的手渐渐地开始恢复了一丝丝的知觉。也许大家会拿这―段来调侃，但是我一点都不介意，我为路途中的这些深深地感动，那些在徒步的过程中曾经因为背着沉重的背包无法自己去系敞开的鞋带而帮你系过鞋带的人；曾经因为鞋带冻僵了无法拖下鞋子而没有给妈妈脱过鞋子而帮你拖下鞋子的人；曾经因为双手失去知觉用自己的胸怀为你捂热双手的人。不是每一次都有这样刻骨铭心的经历，患难见真情，每―次的徒步，无论多么艰难，我的心都是暖的。我对自己说，SUMMER，你是一个坚强、快乐的女孩，永远像夏天一样灿烂的女孩，走过了今天，在今后的人生当中还有什么过不去的槛呢，困难算什么呢，困难就是你生活中的小菜。

扎营之后的情况并不乐观，由于超出了计划一天，大家都没有留存多余的食物，四人已经断了口粮，气罐的火焰也再慢慢地减弱，大家小心翼翼地计划着晚餐，并为明天未知的前程不觉地保留了仅有的一点点食物。在这荒凉的大山中，无法和外界联系，不能不为保持最后的体力留存一些能量。当面临生存考验的时候，人的本能可以预知一切的未知。

A、B、C三个计划

大家在商量着明天的对策，探路负的声音渐渐清晰。最后终于达成了 A、B、C三个计划。

夜慢慢的静下来，未知的路途、不够一天的能量、即将濒临崩溃边缘的精神。这一夜又是―个思绪万分的不眠之夜。