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基因治疗的基本策略模板(10篇)
时间：2023-07-14 16:25:05
导言：作为写作爱好者，不可错过为您精心挑选的10篇基因治疗的基本策略，它们将为您的写作提供全新的视角，我们衷心期待您的阅读，并希望这些内容能为您提供灵感和参考。
篇1
目前我国基本医疗保险已经覆盖12.95亿人，覆盖95%以上人口。随着我国医疗卫生体制的改革，覆盖面已经基本涵盖了城镇居民、农民及外出打工人群。人们在享受医疗保险带给我们医疗保障的同时，医疗费用的快速上涨，也给医保基金带来了沉重的负担。因此，若何有效控制医疗保险费用的过快增长，是医疗保险制度健康、有序、稳步发展的前提，是保障人民群众健康的物质基础，同时，也是医疗保险事业平稳运行的基石。本文结合医疗保险管理的实际，对我国医疗保险运行机构如何控制医疗保险费用的过快增长进行分析和探讨。
一、医疗费用过快增长的原因分析
引起次均医疗费用和就医频率增加的因素很多，从对部分省份医疗基金运行的实际情况分析，主要影响因素包括以下方面：
（一）正常医疗需求的增加。
一方面，基本医疗保险制度从无到有，居民生活水平不断提高，使人们的医疗需求得以正常释放，直接影响到了就医频率的增加。同时，2009年开始，各统筹地区为了合理控制医疗保险统筹基金的结余规模，分阶段、不同程度地对本统筹地区医疗保险待遇政策进行了调整。例如：提高医疗保险统筹基金年度最高支付限额和共付段医保基金支付比例、增设门诊大病病种等。在降低参保人员个人负担的同时，提升了参保人员的就医意愿，从而影响到了就医频率的增加。
另一方面，我国城镇职工参保人群年龄结构处于一个逐渐老化的趋势中，各种慢性疾病、危重病发生概率增加，直接导致就医频率和次均费用的增加。统计数据显示，退休人员的次均门诊费用与在职人员差别不大，次均住院费用、门诊就诊率和住院率却差别明显。
（二）以量补价的过度医疗现象普遍存在，推动医疗费用大幅增加。
受国家价格政策因素的影响，医疗机构通过提高医疗收费项目价格的创收途径受到制约，同时又由于我国绝大部分统筹地区均采用项目付费的结算方式，刺激了各医疗机构通过增加医疗服务提供量和种类来创收。以量补价的过度医疗情况已成为我国医疗费用不合理支出快速增加的重要原因。
（三）先进医疗技术在临床推广，对高级别医院的次均费用影响较大。
随着科学技术的迅速发展，新的医疗仪器设备、药品和诊疗技术层出不穷，极大地提高了诊疗水平，在解决疑难杂症方面起到了重要作用。与此同时，医疗技术的进步，其本身的高科技价值也带来了医疗费用的攀升。
二、控制医疗费用上涨的应对措施
医疗卫生资源的有限性与医疗服务需求的不断膨胀之间的矛盾，医疗保险筹资与支出之间的矛盾，医疗保险支出与积累之间的矛盾，是关系到社会保险事业持续发展的关键。根据医疗费用上涨的特点，在保障医疗需求合理增加的前提下，结合电力行业实际，应从以下几方面采取措施，控制医疗费用的快速上涨。
（一）加大医保政策宣传力度。
我国现行的是“低水平、广覆盖、保基本”的医疗保障制度和“以收定支、收支平衡、略有结余”的基金管理原则。医保部门应加强医保政策的宣传，使参保人员明白基本医疗保险保的是基本医疗，而不是特需医疗。基本医疗就是因病施治，进行合理的检查、用药及治疗。不根据病情需要，盲目要求医生多开药、开贵药，不仅不能对症治疗，还会给自己和医保基金造成浪费。
（二）加强政策引导，合理分流病人。
建立双向转诊制度，合理分流参保人员到适合自身疾病治疗的相应级别医院就医。为促使双向就诊制度的有效实施，医疗保险经办机构应积极主动延伸服务，一方面将各定点医疗机构收治的各类常见病的治愈率、次均医疗费用、平均住院天数、个人负担、病人满意度等多种信息定期对外公布；另一方面，对我国医技高超、医德高尚的医务工作者，医疗保险经办机构可以主动进行宣传，尽量减少病人和医院之间的信息不对称程度。
（三）实施医疗保险定点医生管理制度，强化医务人员的自律性。
随着我国五险合一的金保工程二期信息系统在部分地区范围内逐步推广使用，对医疗保险定点医疗机构精确化管理程度提高，管理落实到医生的条件已基本成熟。可以建立部分地区医疗保险定点医生库，制定定点医生诚信评判标准和激励机制，建议全国各省份人力资源和社会保障管理部门将医保定点医生的诚信状况作为医生职称评定的标准之一，提升医生提供医疗服务的自律性。
（四）加强医保稽核管理，确保基金安全。
加强医保稽核管理，加大对违规行为的查处力度，对参保人员将医疗卡、证转借他人使用，恶意骗取医保基金等各种违规行为，要加大查处打击力度，以此强化就医管理，促使参保人员规范就医行为。如：把医保稽核作为医保工作重心之一，通过加强对监管，有效遏制分解住院、降低入院标准、挂床、冒名住院、虚拟住院、过度治疗等不规范医疗服务行为，促进医疗服务质量的提高，维护参保人的权益。
（五）完善医疗保险定点医疗机构管理质量评价机制，实施定点医疗机构分级管理。
篇2
【中图分类号】R341 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0013-02
目前，基因治疗已成为一种全新的肿瘤治疗模式，其中自杀基因治疗是一种颇具临床应用潜力的治疗策略， 但是由于治疗的靶向性成为关系到治疗安全性的瓶颈问题。近年来研究表明[1-5]，超声微泡造影剂有望成为一种新型的体内靶向给药的载体系统。本研究旨在构建超声微泡包裹的特异性双自杀基因慢病毒载体，为临床实时可视状态进行超声定位控释和载质粒微泡基因治疗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的构建与包装
1.1.1目的基因的扩增与TA克隆
提取正常人外周血gDNA，并通过PCR方法扩增出KDRP、CD、TK基因；回收
PCR产物并分别将其链接到pMD18-T载体上，构成重组T质粒；抽提质粒，并对各重组T质粒的酶切鉴定及测序；
1.1.2 慢病毒载体构建与包装鉴定
将经测序证实的T-KDRP、T-CD、T-TK三种质粒上的KDRP、CD、TK元件通过特定的限制性内切酶酶切后，依次连接到经相应酶酶切的pLenti6-EGFP载体上，经脂质体法转染至293T细胞，24h后通过荧光显微镜即可见GFP荧光表达，72h后收集上清，0.45um滤器过滤，25000rpm离心90min，沉淀溶于Hanks溶液，-80℃贮存备用。将梯度稀释的病毒液，加入293T细胞中，72h后置于荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计数发荧光细胞数目，根据病毒用量和稀释度计算滴度。按公式计算病毒滴度：
病毒滴度=GFP细胞阳性数×病毒上清稀释倍数/0. 4m1（pfu/ml）。
1.2 载药粒微泡的制备于鉴定
1.2.1载药粒微泡的制备
声诺维sonovue为磷脂包裹的六氟化硫（SF6），按使用说明注入生理盐水5 ml震荡形成微泡混悬液。取50ul微泡悬液于1.5mlEP管内，再滴加入100MOI病毒载量的病毒上清液，轻轻混匀后室温孵育20 min。
1.2.2载药粒微泡的鉴定方法。
采用Malvern激光测量仪检测载药微泡的粒径大小，光学显微镜观察其外观，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定载药微泡的包封率和载药量。
（1）粒径大小比较
载质粒微泡为白色混悬液，PBS（Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲生理盐水）冲洗，静置后分三层，上层、中间层为微泡，下层为PBS液。去除上层及下层液，取中层液，测定其粒径大小，镜下比较观察载药微泡与空白微泡外观。
（2）包封率的测定
将制备好的含有慢病毒载体的微泡溶液中加入5%乙醇1 mL混匀，6℃，16000 rpm高速离心20min，去上层微泡，取下层液体，加5%乙醇0.5 mL稀释冲洗，再加入适量乙醚，漩涡振摇，6000 rpm离心15 min，取乙醚层，50℃水浴挥干后，加0.5 mL甲醇溶解作为样液，进样量10μL。采用RP-HPLC测定双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的包封率，按下式计算包封率：
包封率（%）=[（投入药量―游离药量）/投入药量]×100%
（3）载药量的测定
以下式计算载药量：
载药量%=（Wt～Wi）/Wc×100%
其中Wt为脂质微泡溶液中药物总含量，Wi为游离药物量，Wc为磷脂用量。
（4）稳定性测定
4℃冰箱贮存，对短期内的载药微泡溶液的质量进行监测。
取少量载药微泡混悬液分别于1d、2d、5d、8d、10 d经光学显微镜（×400）进行观察其形态变化。第10 d的取该样品由Malvern粒径测量仪检测粒径。4℃冰箱贮存10 d后，RP-HPLC测定载药微泡溶液的包封率。
2 结果
2.1 病毒滴度检测结果：
经荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计数发荧光细胞数目，根据病毒用量和稀释度，获得病毒滴度为（3.5×1012pfu/L）的双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK。
2.2 载药微泡质量鉴定：
2.2.1包裹有pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的声诺维微泡与空白声诺维微泡粒径的对比观察：
载质粒微泡呈乳白色混悬液，用磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate buffered saline PBS）冲洗，静置后分三层，上层、中间层为微泡，下层为PBS液。
镜下比较观察载质粒微泡（图A）与空白微泡（图B）的形态，其形态相近，为近似的圆形微泡。其粒径范围92%在2～5μm之间，平均粒径约2.90μm（图A），粒径大小均相似。
2.2.2 包封率和载药量测定结果
采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定载药微泡的包封率和载药量，
得到结果：
包封率为90.6±3.1%。载药量为29.2±0.9%。
2.2.3 稳定性测定：
4℃冰箱贮存10 d后，可见仍为乳白色混悬液，光镜下观察，微泡粒径大小未见明显变化，微泡形态好，大小均匀，相互之间无明显聚集现象，分层情况基本同前，样品经光镜下观察及Malvern测量仪检测发现，与制备初始相比，平均粒径大小约3.08μm），未见明显变化；RP-HPLC测得包封率：86.1±2.8%，没有出现明显药物渗漏。
3 讨论
基因治疗已成为一种全新的肿瘤治疗模式，其中自杀基因治疗是近年来新兴的肿瘤基因治疗的研究热点。自杀基因疗法是利用基因工程技术将自杀基因转入肿瘤细胞进行表达，注入体内的无毒或低毒的前药在表达的特异性酶作用下转化成毒性产物，该产物可作为DNA合成的核苷替代物掺入到DNA中，干扰细胞DNA的合成，从而引起肿瘤细胞的死亡[6]。
本研究所采用的克隆方法并不是将PCR产物直接与表达载体相连接，而是先将PCR产物TA克隆，构建成重组T质粒后再将目的基因与表达载体酶切连接，主要是考虑到：PCR产物直接进表达载体成功率不高；而先进T载体，再酶切连接表达载体，可减少碱基错配，提高成功率。目前己发现的自杀基因体系已有十多种，本实验选择胞嚓陡脱氨基酶基因（CD）和单纯疤疹病毒胸普激酶基因 （HsV-TK简称TK）来构建双自杀基因质粒，是因为研究表明[7]，二者作用机制具有很强的互补性，将其连接在一起，构成融合基因，使两个自杀基因体系协同作用，能显著增强对肿瘤细胞的杀伤作用。同时选用肿瘤特异性启动子KDRP，突破对肿瘤细胞类型的依赖性，扩大肿瘤基因治疗谱。运用增强型GFP绿色荧光蛋白作为报告基因，可直观的检测目的基因的检测和计算病毒滴度。而慢病毒载体最大的特点是可以感染分裂期及非分裂期细胞，容纳外源性目的基因的片段大，可以在体内长期地表达，不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，可在更多范围的宿主细胞内生成高滴度的病毒，己成为当前基因治疗中载体研究的热点。
超声微泡造影剂声诺维可作为一种新型基因载体。在一定剂量超声波的辐照下，利用微泡在超声介导下的空化效应介导目的基因的靶向释放和导入。国内外许多学者通过体内外实验证实空化效应是超声介导基因转染的主要机制，微泡造影剂作为外源性空化核被引入体内后大大增加了单位体积内空化核的数量，降低超声波的空化闭值，增强空化效应，从而提高基因转染效率[3-4]，尤其在抗肿瘤治疗、溶栓治疗等方面具有潜在的重要应用价值。经静脉注入载药微泡后，用超声辐照特定部位，含气体的超声造影剂在超声波作用下会不断地产生非对称性收缩和膨胀，当声能达到一定强度时，微泡破裂药物被释放到超声所辐照的局部组织中。在这一过程中，微泡作为空化核增强空化效应，依靠能量辐射作用，使微泡破坏后释放的药物能够进入血管壁甚至组织间隙，从而发挥定位靶向治疗作用[2]。
而载药微泡的外观、粒径大小、包封率、载药量等是衡量载药脂质微泡质量的最重要指标。我们制作的载双自杀基因慢病毒载体微泡乳化良好，大小均匀，粒径范围92%在2-5μm，与空白微泡相似。微泡内药物的包封率为90.6±3.1%，载药量为29.2±0.9%，均达到较理想的水平。此外稳定性也是衡量载药脂质微泡特性的主要指标之一，它能反映脂质微泡溶液包封率随时间变化的情况。脂质微泡作为药物载体稳定性是指被包裹药物在脂质微泡中的滞留性。经由本实验证实，我们制作的载药微泡同时也具有较高的稳定性。
本研究联合了双自杀基因的杀伤效应、KDR启动子的肿瘤特异性、慢病毒载体的高载性和超声微泡靶向的可控释性等多种技术优点，制备出了较为理想的载有靶向基因药物的微泡，期望为进一步临床实施可视状态下的肿瘤的基因治疗提供一种更加安全、高效的策略。
参考文献
[1] van Wamel A，Kooiman K，Harteveld M，et al.Vibrating microbubbles poking individual cells：drug transfer into cells via sonoporation.J Control Release，2007，112（2）：149-155.
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[6] Shangara Lal， Ulrich M. Lauer， Dietrich Niethammer， et al. Suicide genes： past，present and future perspectives. Immunology Today， 2000， 21（1）： 48-54.
[7] 孔恒，黄宗海，李强，等.腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用.南方医科大学学报，2008， 28（6）： 907-910.
作者简介：
郝轶，硕士，主治医师，新疆医科大学附属肿瘤医院，830011。
基金项目：
篇3
对于颅内胶质瘤的研究已经有一个多世纪的历史，以前的治疗方式都是对患者大脑半球切开，即使这样，患者仍然会受到肿瘤复发的困扰。现如今，医学研究人员会将手术切除、手术之后的化疗和放疗进行综合使用。近年来，一些新的观念和研究方式层出不穷，医学研究人员在不断进行临床研究，效果明显。
1胶质瘤的手术前评估和手术切除
一般来说，手术切除是治疗胶质瘤的一种具体的途径[1]。在进行手术之前，工作人员应该对肿瘤的生长速度，具体的部位以及血供情况进行全面地探讨和分析，做到全方面地了解。不仅如此，医学研究人员还需要对患者的年龄，遗传信息等进行调查，将其写到治疗方案当中，做好预测工作。
正常来说，手术应该以全切形式为主，现如今，医生所应用的手术形式就是以荧光引导。由于人体内部所含有的氨基乙酰丙酸是血红素合成的主要产物，这种物质可以被肿瘤转化为卟啉，能够用以辅助残留肿瘤，其本身的实用价值比较高。在实际的研究中证明，全切的手术方式不仅效果比较明显，而且还会减少复发率。
功能磁共振也是一种比较典型的治疗方法，这种治疗方式往往应用到无创性手术。研究人员可以在不造成任何损坏的情况下进行明确地定位，对于成像效果来说，采用弥散张量成像的形式是比较常见的。可以通过对白质纤维受压位移情况进行了解之后，才能够提供更为合理的建议。对术前的信息进行全面地了解，可以推动肿瘤切除手术的敏感程度，这样可以有效的减少脑功能，同时还有助于肿瘤切除组织的高效发展。
现如今的安全手术方式有很多，其中比较典型的就是神经影像学。但是这种治疗方式也具有一定的局限性，主要是通过对局部的血流量进行判定。皮层功能存在着严重的误差，严重地影响到影像判定的精准度。另外，手术过程中的电生理监测也是一种标准的检测方式，对语言区肿瘤的切除手术的正常进行会起到一定的促进作用[2]。
为了对手术切除程度和患者预后之间的关系进行全面地了解，研究人员做出了不同的实验，结果发现，肿瘤全切之后患者的预后效果，以及生活质量等要明显高于肿瘤半切的患者。因此，在实际的治疗工作中，最好采用全切肿瘤的形式。
2术后的治疗与放射治疗
在高级别的胶质瘤进行切除手术后，很容易出现复发的现象。因此，做好放疗和化疗工作是治疗肿瘤的重要途径。但是现如今的放疗和化疗的效果度不是非常理想，主要的原因就是血脑屏障会对化疗药物的吸收产生一定的阻碍作用，耐药性也比较强。传统的辅助化疗方式对胶质瘤不会产生任何的改善作用。从相关的临床试验中可以看出，很多药物可以被应用到胶质瘤患者的放化疗中，其中替莫唑胺就是典型的代表，不良反应也比较小。但是，胶质母细胞瘤等恶性的肿瘤对于替莫唑胺这种药物也具有一定耐药性，在手术的早期就应用相应的化疗药物可以药物的药效。因此，在手术之后采用替莫唑胺药物进行化放疗可以达到预期的效果。
在对颅内胶质瘤进行治疗的过程中，甲基转移酶也是研究人员研究的重点。如果胶质瘤呈现出阳性则耐药性就比较强。因此，同样可以也可以采用替莫唑胺来进行治疗。
另外，放射治疗也是比较重要的治疗方式。在实际的诊疗工作中主要是通过高能射线引入到肿瘤组织当中，形成大分子的物质结构，其中比较典型的就是DNA物质。在这些大分子物质遭到损坏之后，就可以直接杀死肿瘤细胞。根据研究人员的实际研究，对于三级以上的恶性颅内胶质瘤而言，手术后放疗的方式几乎是一种普遍的治疗方式。但是，不排除有肿瘤复发的可能性。防渗治疗方式存在着一定的局限性，一些放射线可以对活跃期的细胞造成严重地破坏，而且肿瘤组织也会对放射线非常敏感。
TMZ无论是在体外胶质瘤，还是胶质瘤异体种植模型中均被作为放射增敏剂使用，其作用是导致有丝分裂死亡的增加而不是促进细胞凋亡或细胞周期转折点的激活。这进一步巩固了TMZ作为联合放化疗药物的地位。
3胶质瘤的基因治疗及其他新思路
基因治疗是指使用病毒等载体将外源性基因转染至患者肿瘤细胞，以对其进行杀灭或抑制其生长，主要的治疗方案有：反义癌基因治疗，自杀基因治疗，抗血管基因治疗，抑癌基因治疗以及反义癌基因治疗等。在体外实验中，这些治疗方案均在不同水平上被证明有效，然而，以病毒为载体的基因治疗的临床试验显示其对于延长患者生存期及限制肿瘤生长的效果并不显著[3]，主要问题在于载体无法完整地分布于肿瘤组织，另外，载体DNA转染的效率也偏低，如何在安全的基础上提升基因转运效率成为迫切需要解决的问题，在这样的背景下，以神经干细胞为基础的基因治疗得到人们的重视。
4结论
总而言之，现阶段颅内高级别胶质瘤的基本治疗策略是在完善的术前评估下，进行以手术治疗为基础的综合治疗。凭借术中导航及神经电生理监测技术可以在保护脑重要功能结构的前提下尽量全切肿瘤，这为随之而来的术后放、化疗奠定了重要的基础。以TMZ为基础的辅助化疗和联合放化疗已经成为新的治疗标杆，对MGMT的测定为化疗药物的选择提供了重要依据。
参考文献：
篇4
肝脏血供丰富，是恶性肿瘤转移的最常见的靶器官之一，在恶性肿瘤的发展过程中约25%-50%的原发肿瘤转移至肝[1]。如何提高转移性肝癌的治疗有效率一直是肿瘤临床工作的重点之一，正确认识肝转移癌的一般规律和特点，对进一步提高该病的诊治水平具有十分重要的意义。
1 肝转移癌主要来源分析 常见肝转移癌以消化道恶性肿瘤来源为主，所有的消化系统恶性肿瘤均可经肝动脉、门静脉及淋巴途径转移到肝脏，其中以消化道腺癌经血行肝转移最多见。
由于消化道原发灶全部由门静脉回流至肝脏，且手术操作过程中牵拉、挤捏等常使脱落进入血管的肿瘤细胞首先进入肝脏，因而消化道癌易发生肝转移。从分子生物学的角度考虑，消化道癌细胞表面的糖蛋白CEA具有类似免疫球蛋白类细胞粘附分子功能，它由肝脏清除，在肝内与肝细胞结合后，可作为粘附循环中肿瘤细胞的受体，而致肿瘤易在肝脏中滞留，进一步激活新生血管而形成转移灶[2]。从环境土壤学说来看，肝脏血供丰富，能够为肿瘤的高代谢特点提供营养保障。
2 肝脏病理损伤与肝转移癌关系
2.1 肝纤维化/肝硬化与肝转移癌关系 众多的实验及临床研究表明肝纤维化/肝硬化患者很少发生肝转移癌。大多学者认为肝硬化时形成诸多假小叶，由于再生的肝细胞结节的压迫和结缔组织的收缩，使肝内血管、胆管均发生扭曲和闭塞，酶学系也发生相应的变化，以及肝硬化时门静脉压力升高，肝脏收纳胃肠系统的血流量减少。这些变化使已到达肝内的癌细胞不适宜“着床”及生长。
2.2 肝炎病毒感染与肝转移癌关系 UtsunormiyaT[3]报告感染乙肝或丙肝病毒的结直肠癌肝转移率(3/37,8.1%)较非感染者的肝转移率(85/401,21.1%)明显降低。HBsAg感染后出现肝功能损害、肝硬化可能是结直肠癌肝转移的不利因素。病毒感染本身和其引起的局部免疫变化可能起着重要作用。肝炎病毒能够引起特异性免疫反应，有效地抑制和杀灭循环中的肿瘤细胞；同时微环境中NK细胞和吞噬细胞的增加，大大增强了局部组织的免疫功能。
2.3 脂肪肝与肝转移癌关系 Karube等[4]通过向患有脂肪肝的大鼠体内注入鼠结肠直肠癌细胞(RCN-9)，观察到出现转移性肝脏病变的大鼠数量明显少于无脂肪肝的对照组，同时检测到脂肪肝大鼠转移病灶中的微血管密度(microvesseldensity,MVD)低于对照组大鼠，提示脂肪肝的环境不利于癌细胞的生长，转移灶不易形成。
3 肝转移癌的治疗现状分析
3.1 外科手术治疗 结肠癌等原发病灶切除术后，尽可能行肝转移灶切除术，外科手术依然是可切除病灶的标准治疗，一旦有切除可能时，即应进行手术，从而最大程度减轻患者负担，延长生存期。
3.2 局部治疗方法 主要有射频消融(RFA)、无水酒精注射、激光导热治疗(LITT)、微波凝固治疗(MCT)、高功率聚焦超声疗法(HIFU)、冷冻治疗、电化学治疗等方法，其原理主要是采用物理或化学的方法导致癌细胞死亡。
3.3 化疗 肝脏出现转移灶是原发肿瘤发生远处转移的晚期症状表现，已处DukesD期，不管能否切除转移灶，原则上均需根据转移癌的病理类型选择敏感药物化疗。给药途径有全身和区域性。
3.4 放疗 肝转移癌的癌细胞大多数是消化道来源的腺癌，对放疗低度敏感，肝脏组织对放射线的耐受性差，全肝区放疗已基本放弃不用，病灶聚焦放疗有时仍在应用，如γ刀、光子刀等的治疗。
3.5 生物治疗 生物治疗包括免疫治疗和基因治疗两大类，免疫治疗是调动机体各种积极防御因素，提高机体免疫力，能过免疫机制达到治疗肿瘤的目的。基因治疗是应用基因工程技术，干预存在于靶细胞的相关基因表达水平以达到治疗目的，包括直接或间接抑制或杀伤肿瘤细胞，归纳为细胞因子、肿瘤疫苗、肿瘤药物基因治疗及调整细胞遗传系统的基因疗法，目前研究较多的是杀伤或抑制肿瘤细胞生长的基因、增强肿瘤细胞免疫原性的基因、耐药基因等。
3.6 中医药治疗 中医药治疗恶性肿瘤病人,应用祛邪、扶正、化淤、软坚、散结、清热解毒、化痰、祛湿及通经活络、以毒攻毒等原理，以中药补益气血、调理脏腑，配合手术后、放疗和化疗的治疗、还可减轻毒副作用。
4 肝转移癌的现代治疗策略 近年来，围绕提高肝转移癌手术切除率和延长生存期，提出多学科专家组(multidisciplinaryteam，MDT)治疗模式[5]。在病人治疗前、治疗中和治疗后，由多个学科专家组成诊疗小组，定期进行会议，以病人为中心，讨论决定适合每个病人不同病期的诊断治疗方案，以使病人获得最佳的预后。
5 展望 各种治疗方法均有不同程度的缺陷，比如手术及各种局部治疗方法包括动脉栓塞化疗在内，对于潜藏在门脉系统内的微小病变不能处理，从而导致复发；全身静脉化疗往往因药物副作用不能使病灶内药物浓度达到最佳水平，致使肿瘤细胞出现耐药性等。相对而言，利用气囊导管实施的经皮肝隔离灌注术值得研究[6]。
参考文献
[1] Quaia E,Bertolotto M,Forgacs B,et al.Detection of liver metastases by pulse inversion harmonic imaging during Levovist late phase:comparison with conventional ultrasound and helical CT in 160 patients[J].Eur Radiol,2003,13:475-483.
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[3] Utsunomiyat, Matsumata T.Metastatic carcinoma in the cirrhotic liver[J].Am J Surg,1993,166:776.
篇5
2．心力衰竭的基因治疗
心脏收缩-舒张过程中任何一个环节的功能障碍都可能导致心肌的收缩和/或舒张功能降低，从而诱发心力衰竭的产生。心力衰竭的基因治疗靶点即针对此过程中的钙循环相关蛋白和调控因子。基因治疗包括三个基本要素:基因载体、转移方式和靶基因。
(1)基因载体靶基因需要通过特定的载体转移到靶细胞中去，目前常用的基因载体主要分为非病毒载体和病毒载体两大类。非病毒载体可大致分为质粒DNA、脂质体DNA复合物和高分子DNA复合物。寡核苷酸类及其类似物，亦可单独或以复合物的形式作为一种非病毒载体用于基因转移。一种可降解的高分子聚合纳米粒子，具有强大的核酸容量，避免了腺病毒转染有关的安全问题，适合作为基因载体，已得到了美国FDA的批准［3］。病毒载体在临床前研究中应用更为广泛，主要包括腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、反转录病毒和慢病毒载体，病毒载体的应用大大提高了基因转移的效率。重组人类腺病毒载体是转基因治疗模型中最常用的载体，它的优势在于:扩增相对容易，可以达到较高的病毒滴度发挥功能，对靶细胞存在尤其是对心血管系统广泛亲嗜性。无论在体内还是体外环境下，绝大部分心肌细胞都可以被腺病毒有效转染。然而，将腺病毒应用于临床仍面临许多挑战。腺病毒进入机体后，可能会引起强烈的免疫和炎症反应，这将限制其后续的表达。病毒可能感染所有的器官(尤其是肝脏)，不能呈现理想的组织选择性。相对于腺病毒，虽然AAV、反转录病毒和慢病毒载体有着较低的免疫原性，但是AAV难以达到高效价的病毒滴度，对靶基因的装载能力有限以及人体本身存在中和抗体等。反转录病毒载体不能转染类似心肌细胞的不分裂细胞，慢病毒的生物安全性尚待评价。
(2)载体转移途径目的基因转移到靶细胞，除了需要适宜的载体，还要有适合的转移途径。一些可增加血管通透性的化学物质曾被用于促进载体从血管腔转移至心肌，如硝酸甘油、硝普钠、5-羟色胺、缓激肽、组胺及血管内皮生长因子等，但是对于临床心力衰竭患者，考虑到以上物质有降低血压的作用，需谨慎应用。常用的转移途径包括:①顺向注射法:一种为阻塞冠状动脉的顺向注射法，即用球囊阻塞冠状动脉近端，使病毒载体不会逆流或被稀释，但此法存在安全隐患，因为即使短时间的冠状动脉阻塞也可能不能耐受;另一种为非阻塞冠状动脉的延长顺向注射法，此法用于AAV的转移最为有效，而且可作为心力衰竭患者不能耐受冠状动脉阻塞法的最佳选择。尽管这种方法并不能感染所有心肌(约60%)，但它更符合冠状动脉的正常生理血流特点。重度心力衰竭患者接受携带SERCA2a的AAV1转染的临床研究，即采用了延长顺向注射法。另一种为循环灌注技术，通过经皮的最小微创手术建立心肌的独立灌注区域，使冠状动脉和冠状窦之间形成一个闭合回路，此法在携带SERCA2a的腺病毒载体和AAV转染绵羊心力衰竭模型中应用，证实可显著改善心肌收缩力［4］。②逆向注射法:经冠状静脉逆向注射对于有冠状动脉疾病的患者来说是一个非常好的选择。然而，逆向注射法对不能耐受冠状动脉阻塞的患者也存在操作困难。③直接注射法:经过外科手术或经皮介入将载体直接注入到心肌组织，此法可避免许多血管内途径带来的潜在弊端:肝脏和脾脏的首过消除作用、中和抗体的效应、T细胞应答以及血管内皮屏障的不渗透性。直接注射法仅将病毒载体转移至注射部位心肌。④心包腔途径:经由心包将载体转移，载体会优先在心包邻近的心肌细胞中表达。如何最优化心包转移法的治疗效应主要取决于多少比例的靶组织需要被纠正。局灶性的基因转移适于局部缺血的心肌组织，弥散性的基因转移更适于纠正整体的心功能不全。⑤手术转移:通常需对实验动物进行开胸手术，继而采用直接、顺向或逆向注射。然而，临床心力衰竭患者能否耐受此法尚待进一步研究证实。
(3)靶基因理想的靶基因应具备以下特性:在心力衰竭动物模型证实能改善心功能，无致心律失常性，量效关系明确，即靶基因表达越多，心脏功能的改善越明显［5］。如表1所示，迄今用于心力衰竭转基因治疗的靶基因包括［6-18］:钙循环相关蛋白:①过表达SERCA2a:早在20余年前，Gwathmey等即发现，无论心力衰竭病因如何均存在明显的钙循环异常，且部分归因于SERCA2a的活性下降。大量的心力衰竭动物模型结果显示，过表达SERCA2a基因可显著增加心肌收缩功能，在容量负荷过重所致的心力衰竭猪模型，甚至可改善心室重构［6-7］。另外，过表达SERCA2a可修复心肌能量供应和利用的失衡，降低室性心律失常发生，增加冠状动脉血流［8，19］。②抑制PLN:抑制PLN的表达，可起到与过表达SERCA2a相似的效应，进一步改善心肌的收缩和舒张功能。在起搏诱导的羊心力衰竭模型，通过基因沉默抑制PLN的表达，2周后，即显示PLN抑制组左心室舒张末径显著减小，射血分数显著增加［9］。利用RNA干扰技术，将携带抑制PLN表达的基因序列的AAV9，通过静脉注射转染心脏结果显示:PLN蛋白表达下降了75%，SERCA2a的活性部分恢复，心力衰竭大鼠的血流动力学特性显著改善，收缩功能、舒张功能各项指标均恢复正常，心室肥厚、心肌纤维化程度均明显下降［10］。③S100A1:S100是一类钙结合蛋白，其中S100A1主要在心脏表达。S100A1参与了对细胞内外Ca2+调控的多个环节，可增加肌浆网SERCA2a和RyR2的活性促进心肌的收缩和舒张，调节细胞膜的顺应性和对Ca2+的反应性，调控Ca2+介导的线粒体的能量代谢［20-21］。在心肌梗死后心力衰竭猪模型，通过冠状静脉逆向转移法，将AAV-S100A1注射至左心室非梗死区结果显示:注射14周后，S100A1治疗组修复了肌浆网的钙循环障碍，抑制了进行性的心功能下降，逆转了左心室重构，且不增加室性心律失常的诱发率，证实了S100A1转基因治疗的长期有效性和安全性［11-12］。β肾上腺素受体(β-AR)系统:心力衰竭患者的β-AR往往呈现为表达下调。将携带β2-AR的腺病毒经冠状动脉转染兔心肌细胞，发现在转染后第1周、3周时，反映心肌收缩力的指标dP/dtmax明显增加，且心肌细胞对β-AR激动剂异丙肾上腺素的反应性显著增强［22］。过表达β2-AR的小鼠亦显示心脏功能得到明显改善。G蛋白偶联受体激酶(GRK):β-ARs与G蛋白之间的相互作用是通过激酶对偶联受体的磷酸化调节作用来实现的。GRK2是心脏中表达最多的GRK，它在心力衰竭时表达增加，导致β-AR信号通路敏感性下降，功能障碍。在心肌梗死后心力衰竭小鼠模型，选择性的抑制GRK2表达，结果发现10天后，GRK2抑制组小鼠生存率增高，心室重构延缓，心肌的收缩力增强［23］。β-ARKct多肽是GRK2介导的β-AR失敏的抑制剂。将携带β-ARKct的腺病毒感染心梗后心力衰竭兔，发现转染后3周，心室功能明显改善［16］。β-ARKct过表达的阳性结果在猪的心力衰竭模型上亦得到验证［17］。腺苷酸环化酶(AC):心肌细胞接受儿茶酚胺刺激，经由β-AR使细胞内AC激活，生成cAMP，这是正常的生理反应。分离过表达VI型AC的转基因小鼠心肌细胞，发现cAMP表达增高，心功能增强［24］。在起搏诱导的心力衰竭猪模型，转染携带Ⅵ型AC基因的腺病毒，结果显示可显著改善心脏功能和逆转心室重构，且这种效应与cAMP的生成增多具有明显相关性［18］。
3．心力衰竭基因治疗的临床试验
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【中图分类号】R635 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）06-3523-02
老年高血压是常见的老年慢性疾病，具有脑出血、脑血栓、脑栓塞、心力衰竭、肾脏损坏等多种严重并发症，是老年人致死或致残的主要危险因素。流行病学调查显示：我国65岁以上老年人中35%有高血压，其中67.4%的患者血压没有得到较好的控制，因此实现老年高血压患者平稳、安全降压，对减少并发症及死亡具有重要意义。对本文就老年高血压临床特点及药物治疗现状综述如下。
1 老年高血压临床特点：老年患者因病程长、伴发病多、药物治疗种类多而具有以下特点[1-3]：
1.1 单纯收缩期高血压多：
表现为收缩压升高、脉压增大，并且随着年龄增张，单纯收缩期高血压（Isolated Systolic Hypertension， ISH）发病率也在升高。研究显示：随着脉压增大，老年患者心血管事件发生率及死亡率也在升高。
1.2 老年高血压患者性低血压及卧位高血压发生率高：
多由于脱水、失血等诱因、或长期不规律服用降压药、抗抑郁药等相关，治疗上更注重纠正诱因、非药物治疗。
1.3 血压波动大：
血压“晨峰”现象多，同时易发生餐后低血压（Postprandial Hypotension， PPH）。
1.4 老年高血压多病共存情况多：
高血压病程越长，靶器官受损的机会就越多，与多种疾病共存的机会就越高，如脑血管病（脑出血、缺血性脑卒中）、心脏疾病（心肌梗死、心力衰竭）、肾脏疾病（糖尿病肾病、肾功能受损）等。并且血压控制不理想，发生率越高。
1.5 难治性高血压发生率高，且难治性高血压能加速靶器官损伤。
2 老年高血压治疗
老年高血压降压理念已由单纯降压转为降压达标。高血压治疗的主要目的是：最大程度地降低心血管病发病和死亡危险。我国指南建议降压目标值确定为
2.1 利尿药
利尿剂是临床上应用最早的降压手段之一。2011年美国老年高血压治疗专家共识推荐利尿剂是老年降压治疗的一线药物，而且也是联合用药的首选药物。其作用原理主要是通过减少钠和体液潴留，降低血容量而使血压下降。适用于轻、中度高血压，尤其适宜于老年人收缩期高血压及心力衰竭伴高血压的治疗，可单独用，并更适宜与其它类降压药合用。但是利尿药物对于血糖、血脂、及尿酸有影响，对于合并有糖尿病、高脂血症、高尿酸血症患者应用受限，长期应用还需检测电解质，预防电解质紊乱。有研究发现吲达帕胺和托拉塞米除有与普通利尿药相似的降压作用外，还有一定的抗钙作用，是一种新型强长效降压药并且对血糖、血脂代谢影响小，尤其适用于左心室肥厚的轻中度高血压患者，避免了高血糖、高脂血症限制利尿药物的应用[5-6]。在老年高血压患者中，特别是有心脑血管急症高风险因素的患者中，尤其要注意初始剂量需小，以免过度利尿引起机体脱水，血液高凝，易导致脑心梗等。
2.2 钙通道阻滞剂
钙通道阻滞剂（Calcium Channel Blockers， CCB）类药物作用机制是通过抑制平滑肌L型钙通道从而降低细胞内钙离子浓度，使平滑肌松弛，血管扩张从而发挥降压作用。从结构上分为二氢吡啶类和非二氢吡啶类。CCB由于其降压治疗耐受性好，尤其适用于血管弹性差、左心室舒张功能降低、合并其他心血管异常的老年患者，但是对于心脏传导阻滞和心力衰竭患者禁用非二氢吡啶类钙拮抗剂。目前指南推荐长效二氢吡啶类CCB作为老年高血压患者降压治疗的基本药物，与其它基本降压药物均可联合使用[7]。该类药物在老年高血压患者应用中需注意避免短效、大剂量应用，预防性低血压的发生。
2.3 β受体阻断药
其降压机制是抑制交感神经，降低心肌收缩力，减少心输出量，增加左室射血分数，改善心率变异性，增加心力衰竭患者的运动耐量。β受体阻断药在高血压治疗中应用存在争议，日本抗高血压指南不把该类药物作为常用药物，但在欧美及我国，该类药物仍为基础用药，尤其适用于伴有冠心病的高血压患者。该类药物在老年高血压治疗应用中需注意，因为老年患者常存在心动过缓、窦房结功能异常、慢阻肺等疾病，临床应用时需严格掌握适应症，同时应当注意，尽量选择卡维地洛、美托洛尔等高选择性长效类β受体阻断药[8]。
2.4 血管紧张素转化酶抑制药和血管紧张素Ⅱ受体阻断药类药物
血管紧张素转化酶抑制药（Angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）主要降压机制表现在两点：其一就是抑制循环和局部组织中的转换酶，使ACEI 不能转变为血管紧张素（Angiotensin type Ⅱ receptor， ATⅡ），从而使血管舒张，降低血压； 另外就是减少缓激肽的降解，使体内缓激肽水平升高，扩张血管，降低血压。ACEI不仅具有良好的降压作用，对高血压患者的并发症及一些伴发疾病也有改善作用，尤其适用于伴有心力衰竭、左室肥大、糖耐量减低或糖尿病肾病蛋白尿等合并症的患者[9-10]。禁用于高血钾、妊娠、肾动脉狭窄患者。最常见的不良反应是干咳，也是治疗中停药或者换药的主要原因。
AT1受体拮抗剂（Angiotensin type Ⅱ receptor blockers， ARB）类药物的降压及肾脏保护作用与ACEI相似，咳嗽等副作用较少，血管神经性水肿罕见，尤其适用于不能耐受ACEI出现咳嗽等副作用的患者。
2.5 α 受体阻滞剂
α1 受体阻断剂能选择性阻断血管平滑肌突触后膜的α1 受体，使血管扩张，致外周血管阻力下降及回心血量减少，从而降低收缩压和舒张压本类药物降压作用明确，对血糖、血脂代谢无副作用为其优点，但可能出现性低血压耐药性，使应用受到限制。
3 抗高血压治疗的新技术
3.1 肾脏交感神经射频消融术
随着医学介入技术的不断发展，在抗高血压特别是难治性高血压方面，研究发现经皮导管肾脏交感神经射频消融术治疗顽固性高血压具有较好的应用前景，同时肾脏交感神经射频消融术可改善糖代谢和耐药性高血压的控制情况[11-13]。肾交感神经射频消融术是治疗顽固性高血压的技术，在我国几家医院已应用于临床试验，但由于远期结果尚不明确，目前在国内只有几家医院在专家严格把握适应症的条件下开展，不过相信随着研究的不断深入，肾交感神经射频消融术将会为难治性高血压提供新的治疗策略。
3.2 基因治疗
遗传因素作为高血压发病的原因之一，基因治疗也成为抗高血压治疗的热点。基因疗法包括基因增强和基因抑制两方面。基因增强就是通过静脉注射或靶组织局部注射将目的基因转染到体内，使之表达相应蛋白以达到治疗高血压的目的，此类基因有一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase， NOS）基因、ANP基因、肾上腺髓质素基因、肾素结合蛋白基因等；基因抑制主要采用反义技术和de2coy 技术，对引起血管收缩和高血压的过分表达的基因采取反义抑制或封闭，抑制复制、转录及翻译，从而抑制引起高血压的活性蛋白的产生，相关研究主要集中在血管紧张肽原和AT1受体的基因抑制[14-16]。目前动物实验研究发现基因治疗不仅能够持续稳定降压，还有可能从遗传基因层面控制高血压的发病及家族遗传。动物实验研究结果令人鼓舞，但是转化到临床应用还有不少问题尚需解决，如靶基因的选择与界定、安全有效的载体选择等，还需进一步研究。
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【关键词】 腺病毒；骨形态发生蛋白2；骨髓基质干细胞；基因治疗
BMP2是最主要的骨形成调控因子之一，在体内和体外能够诱导干细胞分化和骨形成。骨组织工程中应用缓释技术将BMP2加入载体的方法虽然取得了一些成果，但从理论到技术均有尚不完善之处。本实验采用体外基因治疗策略，将携带BMP2基因的重组缺陷型腺病毒表达载体（AdBMP2）转染骨髓基质干细胞(BMSCs)，检测BMP2基因表达，观察基因转染对BMSCs增殖及成骨分化的影响，探讨其作为内源性BMP2的“生物发生器”以及骨组织工程种子细胞的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 腺病毒载体及细胞 AdBMP2、携带β半乳糖酐酶基因的腺病毒对照载体（AdLacz）和人胚肾293细胞，由中国医科大学附属盛京医院骨科李建军博士提供。通过感染293 细胞扩增病毒，测定AdBMP2滴度为2×1010 PFU·ml-1。
1.1.2 实验动物 新西兰大耳白兔，雌雄不限，体质量2.0～2.5kg，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（辽2003-0013）。
1.1.3 主要试剂 DMEM细胞培养基（北京海克隆生物制品有限公司）；胎牛血清（天津灏洋生物制品有限公司）；BMP2单克隆抗体、原位杂交检测试剂盒和免疫组织化学试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；骨钙素、Ⅰ型胶原单克隆抗体（Santa Crus公司）；二抗FITC标记IgG（北京中杉金桥）；Xgal（大连宝生物公司）;碱性磷酸酶检测试剂盒（南京建成生物工程公司）。
1.1.4 主要仪器 垂直电泳仪（BioRad）；转印电泳仪（Amersham公司）；可调温摇床（哈尔滨东联公司）；台式低温离心机（Eppendorf公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；酶标仪（芬兰雷勃集团MK3）；荧光显微镜（日本 Olympus）。
1.2 方法
1.2.1 兔骨髓基质干细胞培养及转染 用全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs，2周左右贴壁细胞基本长满单层，即得到原代培养细胞。按1∶3或1∶4比例分瓶传代培养。BMSCs（P2）长至基本融合时，更换成含2%FBS的DMEM培养液，细胞计数，根据病毒滴度按感染倍数（MOI）为100（即1个细胞用100个病毒颗粒感染）加入相应体积的AdBMP2，过夜。次日换成含10%FBS的DMEM正常培养液培养2 d。同等条件下AdLacz转染细胞（MOI=100），Xgal免疫染色检测转染效率。实验组：AdBMP2转染；实验对照组：AdLacz转染；空白对照组：未转染。
1.2.2 原位杂交、免疫细胞化学染色检测细胞内BMP2基因表达 取各组细胞，以1×105 ml-1的密度接种于多聚L赖氨酸处理过的盖玻片上，待贴壁细胞密度达到50%左右时取出盖玻片，PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定。分别按BMP2原位杂交、免疫组化试剂盒操作步骤进行操作，DAB显色，苏木素复染，透明，封片，光镜观察。
1.2.3 Western blotting检测培养液中BMP2蛋白 各组细胞换无血清培养液孵育12h，收集培养液20ml，冻干机冻干后加入50μl上样缓冲液。取10μl样品，煮沸5min，离心5min，上清以12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（12%SDSPAGE）分离。SDSPAGE电泳在恒压条件下进行，浓缩胶中为120V，分离胶中为160V。常规转膜，封闭，然后按膜面积计算一抗用量（0.1ml·cm-2），使用Tween 20PBS按比例稀释一抗（BMP2单克隆抗体），与滤膜4℃温浴3h；以TPBS按比例稀释二抗（辣根酶标记抗体），与滤膜室温温浴1h；加入生色底物溶液（PBS 9ml+二氨基联苯胺9mg+0.3%LiCl2 1ml，最后加入H2O2至0.14%），室温摇动观察条带颜色清晰，PBS终止显色反应，洗涤，干燥，避光保存。rhBMP2标准蛋白20ng作为阳性对照组。
1.2.4 流式细胞仪分析细胞周期 每组细胞各取6 瓶（1×106瓶-1），胰酶消化收集细胞，用1ml PBS制成单细胞悬液，加入75%冰乙醇4ml固定12h，100μg·ml-1碘化丙啶避光染色30min，震荡混匀，上机检测，联机软件测定分析细胞周期各时相比例，数据采用SPSS统计软件处理，方差分析比较。
1.2.5 ALP活性检测 每组细胞弃去培养液，加100μl 2％Triton100，4℃过夜，按ALP活性检测试剂盒说明操作，测定吸光度，计算酶活性值。同时设空白对照。计算均数，组间差异用 t 检验行统计学分析。
1.2.6 免疫荧光检测骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原表达 将各组细胞接种于预置有盖玻片的6孔板内，2周后取出玻片，PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定。免疫荧光法分别检测OCN、Ⅰ型胶原表达，0.2% Triton X100透化处理，10% BSA室温封闭，一抗4℃湿盒孵育过夜，二抗FITC标记IgG室温避光孵育2 h，PBS漂洗3次，95%甘油封片，荧光显微镜下观察实验结果。
2 结
果
2.1 AdBMP2转染BMSCs及转染率检测
转染后细胞形态无明显变化，边界清晰，生长旺盛，细胞核较大，呈圆形或椭圆形，胞浆中颗粒较多，随培养时间延长多角型细胞增多。AdLacz转染后，细胞可编码产生β半乳糖酐酶，作用于生色底物Xgal，反应产物呈蓝色。与AdBMP2转染同等实验条件下（MOI=100），腺病毒转染效率高达90%以上（图 1）。
2.2 BMP2基因在BMSCs内的表达
原位杂交及免疫细胞化学染色均显示实验组细胞质中有较多棕黄色强阳性染色颗粒（图 2、3），而实验对照及空白对照组则为阴性。结果表明：AdBMP2转染的BMSCs中BMP2基因在mRNA和蛋白水平均呈高效表达。
2.3 Western blotting检测培养液中BMP2蛋白
Western blotting检测显示AdBMP2转染组有BMP2强阳性条带，AdLacz转染组和未转染组为弱阳性条带。AdBMP2转染BMSCs后，分泌的BMP2蛋白含量远高于实验及空白对照组（图 4）。结果表明：AdBMP2转染的BMSCs中分泌性BMP2蛋白高效表达。
2.4 流式细胞仪检测细胞周期
分析细胞周期结果显示，实验组与实验对照组及空白对照组的G1期、S期细胞比例无显著差异（P>0.05），表明AdBMP2转染后，BMSCs的DNA合成以及细胞的增殖未因转染受影响(见表1)。表1 细胞周期流式细胞仪分析结果 AdBMP2转染组ALP活性为(30.21±1.85) U·ml-1，AdLacz转染组为(19.56±2.09) U·ml-1，未转染组为(20.65±1.93) U·ml-1，经 t 检验分析，AdBMP2转染细胞组ALP活性较实验对照组及空白对照组明显增高，差异有显著性（P﹤0.01）。
2.6 免疫荧光检测OCN、Ⅰ型胶原表达
AdBMP2转染细胞的胞浆内有大量阳性绿色荧光物质（图5、6），而实验对照组及空白对照组细胞均为阴性。结果表明，AdBMP2转染后，细胞内有骨钙素、Ⅰ型胶原的高效表达，提示BMSCs向成骨细胞表型分化。
3 讨
论
BMSCs因其取材方便，易于分离，体外增殖能力强，具有多方向分化潜能，经诱导可成骨分化，是目前骨组织工程中应用最为广泛的种子细胞。研究表明，单纯BMSCs作为种子细胞向成骨分化过程较慢，并非是一个自发的过程，需要细胞因子及特定的体内环境作用，而且成骨分化后细胞表型的维持也需要细胞因子的作用［1］。体内移植后早期细胞外基质形成不足时，植入的细胞也会失去依托和紧密的细胞间黏附，局部的成骨微环境形成将受到阻碍，不能及早确立优势成骨细胞群而将阻碍成骨。本实验中也观察到 BMSCs的ALP活性较低，OCN、Ⅰ型胶原含量少，提示成骨活性较弱。因此，BMSCs需经改造以增强成骨活性才能成为理想的种子细胞。
图 6 Ⅰ型胶原免疫荧光（×100）
BMP2是被公认最强的成骨诱导因子之一，是调控BMSCs向成骨方向定向分化的主要因子，而且已开始应用于临床［2］。但BMP2的制备过程复杂，产量低；活性不稳定，在体内环境代谢快，骨诱导时间短；作为外源性蛋白植入体内，用量大时可能会产生毒性反应，还可能引起免疫排斥反应［3］；有报道致力于采用缓释技术来解决这些缺陷，然而支架材料中能否整合足够量的BMP2并持续稳定释放，而且BMP2对理化处理是高度敏感的，在支架材料中能否保持生物活性，成为难以解决的问题［4］。应用基因治疗技术可将成骨诱导因子的目的基因导入靶细胞，经过基因修饰的细胞可持续表达细胞因子，可在局部根据需要持续、稳定、靶向释放内源性细胞因子，促进成骨，并起到维持成骨细胞表型的作用，克服直接应用外源性细胞因子可能产生的上述缺点。
重组复制缺陷型腺病毒因其毒性低、靶细胞范围广泛、转染率高、不与靶细胞发生基因整合等优点，成为基因治疗中常用的载体之一。本研究在重组缺陷型腺病毒载体介导下将BMP2基因导入BMSCs，与实验对照组比较，AdBMP2转染的BMSCs中BMP2基因在mRNA及蛋白水平呈高效表达，培养液中BMP2含量较高。而且观察到AdBMP2转染的BMSCs中ALP活性增强，OCN、Ⅰ型胶原呈阳性表达。ALP活性被认为是衡量BMSCs向成骨细胞方向分化程度和成骨细胞功能状态的一个重要指标［5］。Ⅰ型胶原蛋白主要由成熟的成骨细胞合成分泌，是成骨细胞的重要标志物之一［6］。OCN是骨代谢细胞分化成熟、处于功能状态的标志［7］。因此根据实验结果可以认为，BMP2基因修饰的BMSCs向成骨细胞表型分化，提示BMP2基因的转染使BMSCs高效表达、分泌的内源性BMP2，通过自分泌或旁分泌增强了自身的成骨活性。BMP2促进BMSCs向成骨细胞分化的机理还不十分清楚，目前认为BMP2并不直接作用于靶基因，而是通过BMP2、受体、信号途径和靶基因组成的一个较完整的信号系统发挥成骨诱导作用，BMP2处于系统的核心和启位点［8］。
细胞分化与增殖的矛盾是细胞生物学特征之一，即分化低的细胞增殖能力强，分化高的细胞增殖能力差。本实验观察到AdBMP2转染BMSCs促进了其向成骨细胞的定向分化，但通过流式细胞仪检测分析细胞周期的结果显示，AdBMP2转染的BMSCs的增殖能力并未受影响，与未转染细胞无差异，倒置显微镜观察细胞生长情况也证实了这一点。考虑除了与BMSCs强大的增殖能力有关外，可能还与BMP2对BMSCs增殖有促进作用有关。
综上所述，采用基因技术，通过重组复制缺陷型腺病毒载体介导，可将BMP2基因高效导入BMSCs，基因转染的BMSCs不仅提供了内源性BMP2的局部来源，而且提供了BMP2自身效应的靶细胞，实现了向成骨细胞的定向分化并保持了强大的增殖能力，有望成为骨组织工程中比较理想的种子细胞。至于基因转染的BMSCs能否在局部根据需要持续、稳定释放内源性BMP2，植入体内的转归，以及腺病毒载体的安全性等问题尚需进一步研究。
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篇8
基因编辑技术是一项对基因组进行精确定点修饰的技术，可对特定DN段进行敲除、加入和替换等，从而在基因组水平上进行精确的基因编辑。此过程模拟了基因的自然突变，修改并编辑了生物的基因组，使研究人员可以在极短时间内模拟自然界漫长时间的基因演变，甚至能够完成自然进化中无法完成的基因组改变。在科研领域，该技术可以快速构建模式动物，节约大量科研时间和经费；在农业领域，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的要求，研制如改良水稻等粮食作物；在医疗领域，该技术可以更加准确、深入地了解疾病发病机制和探究基因功能，以及改造人的基因，达到基因治疗的目的等。因此，基因编辑技术具有极其广泛的发展前景和应用价值。
锌指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶 （transcription activatorlike effector nucleases，TALENs）和成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是三大基因编辑技术。这3种技术皆是通过在特定的靶向序列处引入双链断裂缺口（doublestrand break，DSB），继而通过NHEJ途径（nonhomologous end joining，NHEJ）和HR（homologous recombination，HR）途径这2种细胞内DNA修复机制完成修复。NHEJ途径（nonhomologous endjoining，NHEJ）使基因MDNA缺口处有碱基的插入或者缺失，造成移码突变，导致基因的敲除；HR（homologous recombination，HR）途径在提供外源DNA模板的条件下使基因组DNA得到精确的基因修复或靶向基因的添加[1]。由此可见，这3种基因编辑技术本质上均是利用非同源末端链接途径修复和同源重组修复，联合特异性DNA靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。
11ZFNs每个锌指核酸酶单体都是由锌指蛋白（zinc finger protein，ZFP）与非特异核酸酶结合的人工合成酶。此酶的N端部分是能识别含有特定DNA序列的锌指蛋白，C端部分则由非特异性切割结构域Fok I以及连接DNA结合结构域和内切酶的肽段组成[23]。ZFN的特异性取决于ZFP，因此筛选高质量的ZFP是获得高效、特异性的ZFN的前提[47]。ZFP通常由3～6个锌指组成，每个锌指识别基因组中连续的3个碱基。ZFP一旦与基因组中的特定序列结合，Fok I核酸内切酶便会形成二聚体发挥内切酶活性，产生DNA双链断裂的缺口，继而通过细胞内修复机制对断裂部位的基因进行修饰[811]（图1）。ZFN的基因打靶效率一般能够达到30%，可以做到针对特定序列设计ZFN来实现对靶基因的修饰。然而ZFN识别结构域存在的上下文依赖效应大大降低了ZFN设计和筛选效率。目前尚不能针对任意一段序列均可设计出满足要求的ZFN，也不能在每一个功能性染色体区段都能够顺利找到适合的ZFN作用位点。在ZFN的筛选和设计方面存在较大的技术困难之外，其制备价格也比较昂贵。此外，ZFN的脱靶切割也往往会导致细胞毒性。综上这些因素使得ZFN在基因治疗领域的应用有一定的局限性。
12TALENsTALEN是植物病原菌黄单胞杆菌Xanthomonas sp.产生的TALE蛋白的中央区域结构域与FokⅠ核酸内切酶结构域组合而成的一类重组核酸酶。TALE蛋白的中央区域结构域是该蛋白识别特异DNA序列的结构域。它包含了155～195个蛋白单元模块，每个模块单元有34个氨基酸残基，其中除第12和13位氨基酸可变外，其他氨基酸都是保守的。因此，这第12和13位氨基酸被称作重复可变的双氨基酸残基（repeat variable diresidues，RVDs） 位点[12]，是靶向识别的关键。由于TALE存在多种变体，所以可以构建出靶向基因组中预设DNA靶位点的多种TALEN。相比ZFN技术，TALEN使用了TALE蛋白的中央区域结构域代替ZFP作为人工核酸酶的识别结构域，更好地解决了DNA序列识别特异性低的问题。TALE蛋白中央区域结构域对碱基的识别只由2个氨基酸残基决定：组氨酸天冬氨酸特异识别碱基C，即HD（His Asp）C；天冬酰胺异亮氨酸识别碱基A，即NI（Asn Ile）A；天冬酰胺甘氨酸识别碱基T，即NG （AsnGly）T；天冬酰胺天冬酰胺识别碱基G或A，即NN（AsnAsn）G或A；天冬酰胺赖氨酸识别碱基G，即NK（Asn Lys）G；天冬酰胺丝氨酸可以识别A，T，G，C 中的任一种NS （AsnSer）A，T，C，G [1314]（图2）。这种与DNA碱基一一对应的方式在设计上相对于ZFN要简单得多。然而，在实际构建过程中，TALE分子的模块组装和筛选过程也比较繁杂，通常需要大量的测序工作。这使得该技术的使用成本较高，对于普通实验室的可操作性较低。此外，TALEN分子比ZFN大得多，因而在不能高效导入细胞方面也限制了它的应用。
13CRISPR/Cas9CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPRassociated protein）系统是在细菌和古细菌中发现的一种获得性免疫系统[15]，由成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR与Cas蛋白组成，能特异性识别外源病毒或质粒的核酸物质，并对其进行剪切，起到防疫外源核酸入侵的作用[16]。其中CRISPR簇通过转录生成一段非码RNA，即CRISPR前体
的靶标可设计为针对一个基因，也为针对多个基因，都能达到有效的特异性位点编辑的效果。CRISPR/Cas9系统已被公认为是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第3代“基因组定点编辑技术”。ZNFs和TALENs作用时均是采用蛋白质对DNA序列的识别，而CRISPR/Cas9对靶序列的识别是RNA与DNA的碱基配对过程。该识别方式使得CRISPR/Cas9与前二者相比更为精准，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性。CRISPR/Cas9所有成分都可以通过导入质粒进行表达，因此也省去了耗时耗力的蛋白质工程过程。同时，研究人员可以通过生物信息学分析，设计出针对绝大多数基因的特异性靶标识别crRNA。因此，与前2代技术相比，CRISPR/Cas9成本低、制作简便、快捷高效、脱靶率低的优点使其迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具，逐渐成为当今分子生物学领域最炙手可热的技术之一。然而CRISPR/Cas9 系统也存在着一些不完美之处：Cas9 蛋白对于目标序列的识别除了依靠crRNA序列的匹配之外，目标序列附近必须存在一些小的前间区序列邻近基序（PAM），因此Cas9 蛋白对于设定序列的切割仍有局限性；另外和ZFNs及TALENs技术一样，CRISPR/Cas9也面临着如何控制双链断裂之后的非同源末端连接修复可能会随机产生细胞毒性的问题。
14 NgAgoCRISPR是以RNA为向导寻找靶向序列，而NgAgo则是以DNA来担任向导。韩春雨等的工作显示，NgAgo可结合24个碱基的gDNA，比CRISPR结合19个碱基的gRNA要长5个碱基，因此理论上精确性要高1 024倍，脱靶率也较低。然而，不同于CRISPR/Cas9技术大量运用已获得了实践验证，NgAgo的作用效果还有待于今后工作的检验。
2基因编码技术的应用
21在基因治疗中的应用随着DNA双螺旋结构的发现和以DNA重组技术为代表的现代分子生物学技术的发展，以及人类对疾病认识的不断深入，越来越多的证据表明，许多疾病都与基因突变、缺失或表达异常有关，由此基因治疗技术顺势而生。基因治疗是指应用基因工程技术将正常基因或有治疗作用的基因引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治疾病。其最核心的策略是通过细胞内基因修饰来治疗疾病。近两三年来，基因编码技术作为该策略的新生力量开始活跃在基因治疗的舞台上，在癌症、遗传性疾病和逆转录病毒相关的传染病等疾病的治疗方面取得许多堪称跨时代的佳绩。
癌症治疗方面：2015年11月英国伦敦大奥蒙德街医院（Great Ormond Street Hospital）的医生第一次依靠使用“分子剪刀”修改基因的疗法，成功地治愈了一名患有“无法治愈的”白血病的1岁女孩“莱拉”（Layla）。其治疗方案是利用TALEN蛋白对异体T细胞进行基因编辑，去除内源性TCR（提高肿瘤杀伤特异性）及CD52（避免药物alemtuzumab的干扰），并命名为antiCD19 CART细胞，再将这些经过设计的“人工培育的免疫细胞”输入患者体内去捕捉和杀伤肿瘤细胞。经过1个月的治疗，这名女孩目前摆脱了癌症，身体状况很不错，成为世界上首次用基因编辑治愈的白血病女孩[18]。此外，科学家们在过去的几十年中已经确定了许多肿瘤治疗中相关的基因，包括原癌基因、抑癌基因、基因组修饰类、基因抗药性基因。近2年，研究者们已经开始利用基因编码技术对上述基因开展了大规模的基因编辑修饰研究，预计今后几年内会出现多项癌症治疗方面的重大突破。
遗传性疾病治疗方面：2015年底《Nature》杂志发表的对2016年热点研究领域的展望（The science to look out for in 2016）中提到美国加利福尼亚州里士满Sangamo生物科学公司将计划开展利用ZFN纠正导致血友病基因缺陷的人体试验，并对其研究成果表示非常期待。另外该公司还与马萨诸塞州剑桥市的Biogen公司合作开始了另一项试验，尝试通过该技术提高β地中海贫血患者体内一种血液球蛋白的功能[19]。已有研究证实人β珠蛋白（HBB）基因的突变可能导致地中海贫血症。我国中山大学黄军就和他的团队利用CRISPRCas9基因编辑技术，修改了人类胚胎HBB基因的DNA，为治疗地中海贫血症提供了可能。该研究中一共使用了86个胚胎，48 h后有71个胚胎存活，其中在54个接受了基因测试的胚胎中仅有28个胚胎的基因被成功修改，但其中只有一小部分包含替代的遗传物质。该研究是史上第一例利用基因编辑技术改造人类胚胎细胞的案例。尽管该研究使用的胚胎均为无法发育成婴儿、不能正常出生的胚胎，该成果的伦理问题在西方仍引发巨大争议，由此《Nature》的记者和编辑们最终将黄军就选入了年度十大人物之列[20]。多种肌肉营养障碍症（duchenne muscular dystrophy，DMD）是表达dystrophin蛋白的基因发生移码突变，导致不能形成有功能的抗肌萎缩蛋白dystrophin所引发的一种遗传性疾病。2014年研究者已利用CRISPR技术成功修复了小鼠胚胎中的dystrophin基因缺陷。今年，西南医学中心的Chengzu Long，杜克大学的Charles Gersbach，哈佛大学Amy Wagers 与MIT张锋合作研究组这3个独立的研究组又分别完成了小鼠成年体的基因修复。其中Chengzu Long研究组的研究方案为利用腺病毒将gRNA以及CRISPR/Cas9导入肌肉细胞，利用CRISPR/Cas9切除有缺陷的DN段，使小鼠能够产生较短版本的有功能的dystrophin蛋白[21]。
逆转录病毒相关传染病的治疗方面：HIV病毒的基因会整合到病人的基因组上。利用抗逆转录病毒药物治疗仅能抑制HIV病毒的复制但对整合在细胞中的病毒DNA不起作用，一旦停止服用药物这些病毒余孽就会起死回生，开始产生艾滋病原体。因此只有清除整合在宿主靶细胞上的HIV病毒基因才能实现根治艾滋病的梦想。2013 年，朱焕章等设计并获得了一对能特异靶向多数HIV亚型基因保守区LTR （long terminal repeat） 的ZFN，并证实该ZFN能特异性靶向HIV感染及潜伏细胞系上的HIV1前病毒LTR，且介导了HIV1整合基因的高效切除，亩获得了显著抗HIV感染的效果[22]。今年，Rafal等[23]利用CRISPR/Cas9技术使带有HIV病毒的T细胞失去活性，同时病毒复制在受感染细胞中降低了90%。这一治疗方案预计在两三年后开展临床试验。
22在新方法学及动物模型制备上的应用当前，各类基因敲除（knockout）和基因嵌入/置换（knockin）基因工程动物及细胞系已经成为现代医学认识疾病发生发展规律、研究疾病预防和治疗的重要实验工具和手段。传统的基因工程动物制备工艺――基因打靶技术是基于胚胎干细胞的一种同源重组技术。利用该技术制备基因修饰动物周期较长且存在生殖系统传递失败的风险。新型的基因编码技术系统可在小鼠受精卵中直接进行基因组编辑，因而快速、高效、低成本、无物种限制地一步生成基因工程动物。复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室的研究人员通过CRISPR/Cas9技术进行凝血因子Ⅸ（Factor Ⅸ，FⅨ）基因敲除，快速、高效地构建血友病乙模型小鼠，以期为血友病乙的研究提供更加便捷的途径[24]。Park 等[25]使用TALEN 技术将诱导的多能干细胞中含有F8 基因的140 kb染色体片段倒置，建立了小鼠血友病A模型，并且再次通过TALEN基因编辑工具将其之前倒置的染色体片段再重新恢复到正常。实验结果表明TALEN基因编辑工具既可以建立疾病模型，又可以介导疾病的再次纠正。军事医学科学院的研究人员利用CRISPR/Cas9介导的同源重组，将有丝分裂降解结构域MD（Mitosisspecial degradation domain，MD）插入到进基因组表达框上游，以期周期性持续降解细胞内CTCF（CCCTC binding factor，CTCF）蛋白，从而获得CTCF蛋白特异性降解细胞系，为后续研究CTCF功能奠定基础[26]。
此外，随着现代生物技术的不断发展和完善，基因编辑技术已经变为科研人员的新宠，越来越多的科学家运用其与其他技术相结合进行各种学术研究。第三军医大学西南医院和重庆大学的研究人员通过CRISPR/Cas9介导的同源重组修复方法，用GFP标记HCC细胞中的内源多功能性因子Nanog，证明雄激素/雄激素受体轴可以通过直接结合其启动子，增加Nanog的表达，并促进HCC细胞的干性和肿瘤发生[27]，从而初步阐明了肝癌发生的性别差异的机制。CRISPR/Cas9技术的成熟使得利用多重sgRNA载体高效、高通量编辑细胞内基因成为可能，为新型功能遗传筛选创造了条件。IAA2（indole acetic acid 2）是拟南芥Aux/IAA生长素响应基因大家族中的一员。由于没有该基因的失去功能型突变体，其功能和作用机制的研究受到了阻碍。研究人员在GoldenGate克隆技术的基础上，将每3个sgRNA串联到同一个入门载体中，再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体LR反应，获得最终的表达载体。结果表明，设计的6个sgRNA有4个发挥了作用，产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变，所得到的突变体为后续的IAA2功能研究提供了良好的材料[28]。
23其他应用前景目前，世界各地的实验室已将基因编辑技术应用于生物学研究的各个领域。
预防疟疾：利用CRISPR/Cas9对蚊子的基因进行改造，使其携带一种抗疟疾的基因，从而对疟原虫产生抑制，进而遏制疟疾的传播[29]。另一种改造为导入不孕基因，使疟蚊灭绝[30]。
器官移植：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对猪胰岛素基因进行了无痕定点修饰，使猪胰岛素基因编码生产人胰岛素，成功建立了完全分泌人胰岛素的基因编辑猪。这为糖尿病人提供更为理想的临床异种胰岛移植供体。另外，有研究改造了猪肺基因以利于用于人体肺移植，以及去除了猪器官上的内源性逆转录病毒（PERV）以防止移植器官带来的病毒感染[31]。
生物制药：北京蛋白质组研究中心张普民教授及其研究团队利用CRISPR/Cas9技术对猪受精卵的基因组进行了基因编辑，在猪白蛋白的基因区域插入了人白蛋白的编码DNA，使猪只产生人白蛋白而不产生猪白蛋白[32]。
农业育种改良：利用CRISPR/Cas9技术几年内可实现至少50～100年才能完成的育种改良工作。圣保罗Recombinetics公司利用该技术培育出不会长角的牛，从而使牛无须经历被切去牛角的痛苦过程。目前该公司正致力于培育永远不需要被的猪。
灭绝物种复活：加州大学圣克鲁斯分校Ben Novak将灭绝的候鸽的博物馆标本DNA与现存鸽子进行序列比对，并尝试对现存鸽子进行基因改造，使这些鸽子变得更接近灭绝的候鸽。
3基因编码技术的争议与思考
基因编辑技术可谓当今生命科学界炙手可热的前沿科技。顾名思义，该技术能够对最基本的遗传单位――基因直接进行设计和修改，其意义和价值可想而知。这使得各大公司迅速加入到基因编辑的产业之中。2015年8月，比尔及梅林达・盖茨基金会和谷歌风投基金投资Editas医药公司1.2亿美元；2015年10月杜邦与Caribou生物科学公司达成了合作协议，使用CrisprCas9技术来改进农作物（http：//wwwnaturecom/news/genomeediting7factsaboutarevolutionarytechnology118869）。中国基因编辑技术产业已走在世界的前列：在CRISPR技术数上中国仅次于美国，位居世界第2；目前50多家中国研究机构已提交了基因编辑专利；劲嘉股份与黄军就团队合作开展CRISPR技术治疗地中海贫血在临床应用方面的研究。中泰证券的分析师认为未来5年仅地中海贫血基因治疗的国内潜在市场空间超过500亿元。与此同时，随着基因编码技术的不断发展，CRISPR/Cas9系统相对前两代技术效率提升了10倍以上，操作容易程度提升了100～1 000倍，构建周期缩短至原来的1/12，成本由5 000美元降低至30美元，脱靶率依据最新技术已降低至目前检测技术检测不到的水平。脱靶率、效率、便携性及成本的极大改善，使得该技术更平民化，技术门槛越来越低。它已成为许多车库生物学家/草根生物学家以及生物黑客的新宠。都柏林生物黑客和企业家Andreas Stürmer说，CRISPR是有史以来最了不起的工具，可以在自己的家里玩（http：//wwwnaturecom/news/biohackersgearupforgenomeediting118236）。
但任何事物都有其双面性，基因编辑技术产业虽然能够造福于人类，然而上面所述的巨大的经济利益驱动以及越来越低的技术门槛，再加上人类对自身健康改良的迫切心态极可能导致对该技术的滥用，进而对人类和地球环境形成威胁，甚至造成意想不到的生态灾难。在美国国家情报总监詹姆斯・克拉珀的威胁评估报告中，“基因编辑”已经被列入“大规模毁灭性武器和武器的扩散”威胁名单，与核武器并列（https：//wwwtechnologyreviewcom/s/600774/topusintelligenceofficialcallsgeneeditingawmdthreat/）。因此，关于该技术运用的争议从其诞生之日就已出现，并呈愈演愈烈之势。现有争议最集中之处为关于人类胚胎改造的伦理学争议。史上第一、二例基因编辑技术改造人类胚胎细胞的研究皆出现在中国。2015年4月，中山大学黄军就和他的团队利用CRISPRCas9基因编辑技术，为治疗地中海贫血症修改了人类胚胎基因组[33]。2016年4月29日广州医科大学范勇团队，宣布他们用基因编辑技术制造出一个能对艾滋病毒免疫的人类胚胎[34]。尽管这2例基因编辑研究都使用的是人类三核受精卵（不能正常发育的受精卵），但在国际上仍引起了广泛的关注和全球科学家激烈的讨论。讨论的焦点不在于文章的学术价值，而在于改造人类胚胎细胞的伦理问题。由于基因编译技术引发的伦理问题迫在眉睫，2015年12月1日，由美国国家科学院、美国国家医学院、中国科W院和英国皇家学会联合组织召集的人类基因组编辑国际峰会在华盛顿召开。会议重点了解各方对基因编辑技术的伦理问题的态度和想法。美国再生医学联盟主席兰菲尔（Edward Lanphier）等在《Nature》杂志上发表评论文章称，希望研究人员暂时不要对人类生殖细胞进行基因编辑，否则可能对后代产生无法预测的后果[35]。然而，人类胚胎改造的研究终究为大势所趋。2016年2月1日，英国政府批准了伦敦弗朗西斯・克里克研究所 Kathy Niakan研究员对人类胚胎进行编辑的请求。这项研究成为世界首例获国家监管机构批准的人类胚胎编辑研究。
综上所述，日渐成熟的基因编辑技术已经成为了强力的生物、医学工具，在癌症、遗传性疾病和逆转录病毒相关的传染病等疾病的治疗方面带了巨大的突破，可以快速构建实验新方法和动物模型，推动科研的发展，并在器官移植、生物制药、农业育种改良、灭绝物种复活和中药现代化等方面具有广阔的应用前景。其价值甚至引起了普通民众的广泛关注。人类畅想将来它不仅可去除遗传缺陷、治疗疾病，还可导入长寿、健康、强力的基因，甚至制造完美人类。当然，任何事物都是一把双刃剑，在乐观畅想基因编辑技术可使人类变得更加完美的同时，也不要忘记滥用技术可能带来的潜在风险和生态灾难。建立针对基因编辑技术安全有效的检测手段，制定合理健全的法律道德制度，才能使这项技术更好地应用和造福人类。
4基因编辑在中药发展中的潜在前景
如何让传统中药跟上生命科学现代化的步伐，使传统中医药走出国门，让世界接受中草药，是当今中医药工作者面临的难题。长期以来，由于中医药与现代医学、生命科学之间缺乏有效沟通的桥梁，有逐渐被边缘化的趋势。中药基因组计划将现代生命科学的最新技术和研究成果应用于中药研究，有望彻底改变中药研究手段和方法的落后局面，架起传统中医药学与现代生命科学之间沟通的桥梁。中国中医科学院中药研究所陈士林团队在著名植物学杂志《Molecular Plant》发表丹参全基因组[36]，标志着作为常用中药丹参的遗传密码被破译，为揭示丹参主要药理活性成分丹参酮和丹参酚酸生物合成及其调控的分子机制，促进丹参优良品种选育提供了重要的遗传背景基础。该工作构建了世界上首个药用植物基因组框架图，标志着我国中药研究进入了基因组学时代。目前已有多个中草药如印度大麻、赤灵芝、牛耳草、铁皮石斛等完成了基因组测序。中草药基因组研究的飞速发展为基因编辑技术在中草药研究中的应用带来了极佳的时机和广阔的前景。今后研究者们可以以丹参研究为模板，借鉴国外的植物基因组研究计划的经验，对中草药在结构基因组学、功能基因组学和生物信息学等方向展开研究。在此基础上，利用基因编辑技术开展中药药效成分、药材的生长及抗性相关基因的研究和改造工作，结合先进的育种方法，筛选出既保持“道地血统”，又优质、高产、抗病的中药材优良品种。该工作既有利于实现中药标准化生产，使中药质量可控，又有利于解决当前中药材资源面临的“断粮”困境。
中药药材是现代药物研发最大的遗传信息资源之一。我国在该方面具有得天独厚的优势。《本草纲目》中记载了1 892种药用植物，1995年出版的《中华本草》收集了8 000多种药用植物，而且其中不乏很多名贵，稀缺的药材如人参，虫草等。另有统计表明，我国中草药已有12 000多种。基因编辑技术的成熟也为开发这个药物基因资源带来了良机。基因编辑技术在中药资源的引入和应用，将会为解决这一问题带来新的前景。通过基因编辑技术可以快速获得药材靶基因的突变或是导入异源基因，从而快速鉴定出该基因产物与药理活性成分的相关性和重要性，发掘出新的或更高效的药物相关基因，并可更清晰地阐明药理活性成分生物合成及其调控的分子机制。
尽管将基因编码技术引入中药研究能为传统中草药带来新发展和突破，但与当今各个领域广泛应用基因编码技术相比，其在中药研究中的应用还处于起步阶段，还有许多基础工作有待完善。比如这一技术的应用必须以完善的中药基因资源为基础，如果没有对中药特别是具有丰富药理药效学和临床应用价值的名贵中药的基因资源的研究与开发，基因技术体系的应用必然大打折扣。此外，也不能盲目的为了中药的基因而基因，浪费大量的人力物力资源，应有的放矢的将目标集中在既具有重要临床应用价值的名贵或濒临灭绝的中药基因资源的研究与应用上，为中药现代化搭建良好的基础技术平台，让现代基因技术更好的为传统中药的发展服务。
[致x]李连达院士对本文的选题、框架设计等给予了诸多宝贵意见。
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篇9
【关键词】 快速成型；膝关节模型；CT；DICOM
【Abstract】 This paper has reviewed the clinical practice situation in medical science about rapid prototyping technology. Described rapid prototyping technology general step and clinical practice situation that the ankle bone rolls over . Getting CT image picture of the whole knee joint with spiral CT， it is 1.0mm to scan one slice of intervals. Use DICOM file as the data source and get two-dimensional CT image of the knee joint through the relevant software. Using figure software edit and get shin bone fracture border of knee joint then export the border curve to CAD system and set up the three-dimensional model and export STL file again from CAD system； Paper base model that the ankle bone converts into tibi outside adopting the laser rapid prototyping machine of Model ZSW-I-A and processing STL file into the shin bone. Have used this paper base model on clinically and have got comparatively ideal results.
【Key words】 rapid prototyping；knee joint model；CT；DICOM
快速成型技术是将计算机辅助设计CAD，计算机辅助制造CAM，计算机数字控制CNC，激光，精密伺服驱动系统和新材料等先进技术集于一体，依照计算机上构成的产品三维设计模型，对其进行分层切片，得到各层截面的轮廓。按照这些轮廓，激光束选择地切割一层一层的纸基（或固化一层层的液态树脂、烧结一层层的粉末塑料），或喷射源选择地喷射一层层的粘结剂或热熔材料等，形成各截面轮廓，并逐步叠加成三维产品，从而获得所需的模型或产品的方法［1］。人膝关节是人体最主要也是最重要的关节之一。由于其在临床医学、康复工程、生物机械工程等领域的重要研究价值和应用前景，长期以来吸引了大量的生物力学研究者投入对其的研究［2～6］。利用精确的物理模型可直接用于膝关节的移植和矫形手术，可以以原型为模具，用传统方法做替代膝关节或矫形器械；另一方面可采用生物活性或生物兼容性材料制成的原型直接植入人体，与合金制品相比，具有更好的生物兼容性。其具体的优点是生产周期短；人工骨与被代替骨形基本一致，有利于保持与原有其他器官的匹配；人工骨内部具有微孔结构，组织液和骨细胞容易长入，促进修复过程；在人工骨内部有骨因子，可使人工骨很快与人体微循环组织连通［7，8］。
1 三维模型的重建
制作膝关节模型的技术工作流程是：三维重建原型加工快速模具膝关节模型浇注后处理（见图1）。
2.2 假体工程 膝关节模型的制作可以为临床医学中的“量身定做”问题的解决提供较为有效的解决方法和制作手段，适用于整形外科和假体工程，将RP和CT、MRI技术结合能辅助外科医生迅速准确地实施复杂外科手术，制作膝关节修复体，辅助正畸等。运用膝关节模型，设计师可以根据特定病人的CT或MRI数据而不是标准的解剖学几何数据来设计并制作种植体，这样就极大地减少了种植体设计的出错空间，并且这种适合每个病人解剖结构的种植体确实能设计一个更好的手术结果。能制作出与病人完美配合的种植体，这一点可帮助外科医生大大缩短手术操作的时间。这不但让病人减少了麻醉时间，还能减少费用。由于有了解剖模型，医生可以有效地与病人沟通，借助于病人自己的解剖模型，可以指出关键的区域，从而增加病人的理解。
3 结论
通过快速原型加工的胫骨骨折纸基模型在临床的应用研究，可以得到如下结论：（1）以DICOM文件为数据源的三维建模方法可以得到比较准确的膝关节三维模型。（2）将膝关节纸基模型用于诊断和手术可以大大缩短手术时间，提高手术的质量，增加手术成功率。（3）膝关节纸基模型为母模可以制作出与患者膝关节面匹配良好的修复假体。
4 展望
随着基础科学研究和边缘学科研究的进展，骨科的临床实践正在发生明显的改变。特别是基因研究的深入，将来可以通过功能基因组学等技术早期诊断疾病从而及早采取预防措施。骨科疾病的基因治疗目前多限于动物模型，但是已有多项关节炎临床试验正在进行之中［10～12］。纳米技术的发展为仿生材料的临床应用创造了条件［13］。在不久的将来，金属及塑料材料的应用将会减少，取而代之的是有细胞活性的生物材料［7，8］。现在，快速成型的技术正朝着精密化、高精度、标准化、低成本等方向发展，并且可以实现真正意义上的绿色制造［14］。采用生物材料作为原材料直接成型的个性化假体将是RP技术在医学领域中的发展趋势。
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转贴于
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篇10
[中图分类号]R978[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）11（a）-028-03
乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)性肝炎是严重危害人民健康的常见传染病。自1964年被发现后的40多年里，它成为了无数人挥之不去的阴影。全世界乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阳性者约4亿人，主要分布于亚洲、非洲和拉丁美洲地区[1]。据统计，全球每年约有100万人死于HBV感染相关性疾病，占疾病死亡原因的第9位[2]。我国HBsAg阳性者约有1.2亿人，其中3 000万人为慢性乙肝患者[3,4]。如何预防和有效治疗肝炎成为当今重要的医学课题。现将目前常用的治疗乙型肝炎的现代药物及临床应用作一综述，供医患参考。
1 生物类药物
1.1 干扰素-α
IFN-α结合于其特异的细胞表面受体，诱导细胞表达多种广谱的抗病毒蛋白，包括蛋白激酶A(protein kinase A , PKA)、2'，5'-寡腺苷酸合成酶(2'，5'-oligoadenylate synthetase, OAS)、脱氨酶(adenosine deaminase, ADAR) 和Mx蛋白等。PKA可被细胞内病毒RNA激活, 随后使翻译起始因子-2α(eukaryoteinitiation factor-2α,eIF-2α)磷酸化而失去活性，从而阻止病毒mRNA的翻译，使病毒蛋白合成起始受阻；OAS在细胞内被病毒单链RNA激活，合成寡腺苷酸，继而激活细胞内RNA酶L，病毒RNA降解；ADAR可催化病毒双链RNA中的腺嘌呤转变为次黄嘌呤，从而使病毒解聚。Mx蛋白是一类蛋白家族，可影响细胞内病毒核壳体的转运及RNA的合成[7]。此外，IFN-α通过免疫机制抗HBV[8]。对HBeAg阳性患者的疗效, IFN-α治疗3~6个月，停药6~12个月后，HBeAg转阴率为33%，血清HBV DNA转阴率为37%，HBsAg转阴率为8%。对于HBeAg转阴的患者，其疗效一般会长期维持。有研究表明，HBeAg转阴患者中80%~90%在4~8年内其HBeAg持续阴性[9]。长期的临床随访(7~10年)研究表明，IFN-α治疗可显著改善HBeAg转阴患者的预后，其肝硬化并发症及肝移植发生率显著降低，累积生存率显著提高[10]。目前，临床试验又应用新一代的聚乙二醇-IFN-α(PEG-IFN-α)治疗乙型肝炎，并取得了不错的疗效[11]。
HBeAg阴性的CHB患者，其体内感染的HBV DNA的前核心区发生了突变，从而不能表达HBeAg。这类患者对IFN-α的反应性比HBeAg阳性患者差，有报道显示，以HBV-DNA转阴和转氨酶水平恢复正常为标准，其IFN-α治疗的长期有效率仅为15%~18%[12]。对HBeAg阴性患者采用IFN-α治疗24个月，治疗结束21个月后，其有效率为30%。HBeAg阴性患者IFN-α治疗后，持续应答者发生肝硬化及其并发症的几率和死亡率与治疗无效，治疗后复发与未治疗者相比明显降低[13]。
1.2 胸腺肽α1
胸腺肽α1(thymosin alpha-1, Tα1,Zadaxin)是20世纪70年代末期从胸腺素第5组分(TF5)中分离纯化出的一种小分子生物活性多肽。Tα1分子含28个氨基酸, 广泛存在于机体的胸腺上皮细胞、外周血、大脑、垂体、、滤泡液和羊水中。Tα1在机体免疫应答过程中充当十分重要的角色，其抗HBV的作用机制尚未明确，目前认为可能和增强T细胞及NK细胞应答功能及增强IL-2及IFN产生有关。
Chan HL[14]等实验证明，胸腺肽组与安慰剂组相比治疗结束，治疗结束后6个月、12个月生物化学反应无差异。结论认为，对于慢性乙型肝炎病毒感染胸腺肽能有效抑制病毒复制，但此影响延迟直至停止治疗后12个月。现有剂型为注射剂，疗程6个月，基本和干扰素相似，无任何副作用。胸腺肽α1还可以作为疫苗辅助药来加强乙肝疫苗的效果，其作用特点表现为延迟效应。在治疗结束时对胸腺肽α1的效应率很低，但随访观察中完全效应的病例逐渐增加。单用胸腺肽α1治疗的效应率不高，主张与其他抗乙肝病毒药物联合应用。
2 化学类药物核苷类似物
2.1 拉米夫定(lamivudine,3TC)
拉米夫定是新型核苷类药物，全称2',3-二脱氧-3-硫代胞嘧啶(3TC)。其进人细胞后，磷酸化为三磷酸拉米夫定而发挥作用。拉米夫定作用的靶位是HBV聚合酶反转录活性YMDD(酪氨酸、蛋氨酸、门冬氨酸)基序。在HBV复制周期中，HBV侵入细胞内，其核心部分进入胞核，部分双链的环状DNA分子转变成超螺旋共价闭合环状DNA(cccDNA)，然后合成前基因组RNA，再以此为模板在HBV聚合酶作用下反转录负链DNA，最后复制成部分双链的环状DNA，HBV聚合酶的抑制将抑制前基因组RNA反转录为负链DNA，阻断新合成HBV-DNA的链化，从而抑制HBV的复制。 拉米夫定可快速高效抑制HBV-DNA复制。香港、台湾等地的双盲、安慰剂对照研究[15]发现，每天100 mg拉米夫定口服治疗2周，病人血HBV-DNA比基础值下降97%。每天100 mg拉米夫定治疗52周和安慰剂的HBV-DNA阴转率(
拉米夫定特异性抑制HBV聚合酶反转录活性部位，故毒性极低。迄今为止的临床试验中不良反应的发生率及严重程度和安慰剂组相比无显著性差异，试验病人耐受良好。在临床前动物实验中，使用大于临床治疗剂量几十和几百倍的拉米夫定对大鼠、猫和狗的主要器官无毒性。拉米夫定治疗中存在的问题：停药后反跳，胆红素升高。长期拉米夫定治疗，随着敏感株迅速被抑制，耐药株会逐渐出现。对拉米夫定耐药的HBV突变主要是HBV聚合酶C区的酶活性区YMDD基序的变异，其中蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)替代。YMDD突变株的复制能力低于野生株[17]，因此，继续应用拉米夫定，HBV-DNA的回升往往低于治疗前的水平，一般不出现临床病情加重或恶化。
2.2 阿德福韦(adefovir)
阿德福韦酯在体内迅速完全代谢为母体药物阿德福韦，在细胞激酶作用下磷酸化为活性代谢产物二磷酸盐-PMEApp，此产物与酶的自然底物三磷酸脱氧腺苷(dATP)竞争，抑制HBV-DNA聚合酶(HBV逆转录酶)或通过整合到病毒DNA链后使其发生链终止；PMEA本身也可直接整合到HBV-DNA链中，形成DNA链终结子[18]，使HBV-DNA链停止复制，因而它具有较强的抑制HBV-DNA复制的作用。在为期48周的随机、双盲、安慰剂对照临床试验(序号分别为437及438)中阿德福韦口服剂量为10 mg/d (n=700)[19,20]。试验结果表明，437研究中治疗组与对照组发现肝活检病理改善率分别为53%和25%，血清HBV-DNA对数值分别下降lg(3.57±1.64)和lg(0.98±1.32)，ALT正常率分别为48%和16%。438研究中治疗组与对照组发生肝活检病理改善率分别为64%和35%，血清HBV-DNA对数值分别下降lg(3.65±1.41)和lg(1.32±1.25)，ALT正常率分别为72%和29%。HBeAg阴转率在437研究中分别为12%和6%，继续给药阿德福韦至72周，在此期间HBV-DNA下降程度同前48周的治疗期相同。同时437研究中ALT正常率增加，肝移植病人的临床试验中也取得相似疗效。虽然拉米夫定是抑制HBV的有效的核苷类似物，但在长期应用之后，病人经常出现耐药性，并且随用药时间的延长发生耐药性的比例增加，导致其疗效明显降低[22]。阿德福韦对于拉米夫定耐药病毒株有显著的抑制作用[23]。在迄今为止的实验中，阿德福韦显示了良好的安全性及有效性。
2.3 恩替卡韦(entecavir)
恩地卡韦为新型碳环2-脱氧鸟苷，在体内在磷酸激酶的作用下形成活性的三磷酸化合物，拮抗HBV所需要天然底物脱氧鸟苷三磷酸（dGTP），在细胞内作用半衰期为15 h，在人体内不被肝细胞代谢，主要从肾脏排出。恩地卡韦的作用靶点为HBV的逆转录酶，可以在所有3个环节抑制HBV逆转录酶活性，包括碱基引导（base priming）、从mRNA前体反转录成负链以及HBV-DNA正链合成。
在体外HBV-DNA转染的HepG32细胞的药物抗HBV实验中发现，它是现有抗HBV核苷类似物中作用最强的一种。其抗HBV作用大于LAM 1 000倍，并可降低肝组织中cccDNA量和病毒抗原量。不但对野毒株具有显著抑制作用，而且对基因突变株也具有同样的抑制作用，并且对拉米夫定、泛昔洛韦的耐药病毒株仍然敏感。美国FDA公布的资料表明[24]，对于核苷类似物处治者，无论HBeAg阴性还是阳性，治疗48周后，恩地卡韦治疗组患者的组织学改善比率均显著高于拉米夫定对照组；HBV-DNA较基线的降低幅度以及血清ALT复常率，实验组均显著优于对照组[25]。Wong等[26]对Ⅲ期临床研究组的部分病例进行了肝细胞内HBVcccDNA的检测，初步结果显示治疗48周后恩地卡韦降低肝细胞内HBVcccDNA的作用强于拉米夫定。国内外对恩地卡韦的临床研究结果相似，在未经抗病毒治疗的患者中，总的不良时间发生率为：恩地卡韦0.1 mg组45%、恩地卡韦0.5 mg组40%，安慰剂组42%，无1例发生药物相关的不良事件[27]。
基本适应证为有HBV活动性复制和血清学或肝组织学炎症指标的成年慢性乙肝患者。其疗程在1年以上，目前对停药指征尚无明确规定。治疗期间和停药后密切监察和随访[28]。
2.4 其他
其他抗HBV病毒的核苷类似药物还有泛昔洛韦( famcictovir)、利巴韦林(ribavirin) 、阿糖腺苷(Ara-A)、单磷酸阿糖腺苷(Ara-AMP)，它们通过作用HBV复制不同的阶段来抑制病毒。在临床验证的核苷类似物新品种还有替诺卡韦(tenofovir）、特必夫定(telbivuding)、克来夫定(clevudine)和恩曲他滨(emtricitabine)等，它们比拉米夫定有相同或更高的抗病毒效果，而且对拉米夫定耐药株有效。
3 免疫调节药物
3.1 胸腺因子D
胸腺因子D 对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg有剂量依赖的抑制作用。对HBsAg的抑制效果要优于对照药物IFNα-2b，对HBeAg的抑制效果要略低于对照药物IFNα-2b。现在发现热休克蛋白gp90或它的N-末端片段注入乙肝患者，细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫应答加强，显示其可能通过增加CTL免疫应答增加机体抗乙肝病毒和原发性肝癌的能力[29]。
3.2 树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗
树突状细胞作为抗原提呈细胞在激发抗病毒免疫应答中起着重要的作用。利用HBV特异蛋白在体外预先制备的DC而制成的自体疫苗可望成为未来的治疗方法[30]。
4 其他药物
抗肝炎病毒基因治疗的药物或策略包括反义技术、核酶、基因免疫、干扰肽或蛋白质、负性突变体、单链抗体、RNAi等目前正在研发之中。
5 结语与展望
抗病毒治疗的成败是慢性肝炎能否治愈的关键，由于乙肝病毒进入肝细胞后产生的cccDNA对各种药物的耐药性，细胞核内的cccDNA难以清除，造成停药后，病毒复制的反弹以及长期药物治疗所导致的乙肝病毒突变株的产生，使得到目前为止，对HBV的治疗尚没有一种特效的药物能够达到满意的治疗效果。
随着分子生物学和重组DNA技术的迅速发展，基因治疗及基因疫苗的进一步研制，清除HBV，彻底治疗慢性乙肝将成为一种可能，但总的说来，HBV基因治疗的研究仍有相当长的路要走。尽管HBV基因治疗困难重重，但基因技术仍为HBV治疗带来了新的希望，通过广大学者不懈的努力，相信在不久的将来会取得一定的突破。
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