干细胞培养技术模板(10篇)

导言：作为写作爱好者，不可错过为您精心挑选的10篇干细胞培养技术，它们将为您的写作提供全新的视角，我们衷心期待您的阅读，并希望这些内容能为您提供灵感和参考。

篇1

【关键词】 肠神经嵴干细胞 小鼠 细胞培养技术 细胞分化 Hirschsprung病

0引言

应用神经干细胞治疗某些神经系统的损伤和退行性疾病，经过较长时间的实践已被证明是行之有效的［1］. 肠神经嵴干细胞（gut neural crest stem cells， GNCSCs）起源于神经管背侧，具有干细胞特性［2］，将其用于治疗先天性巨结肠症及肠神经系统干细胞疾病的研究已引起人们的关注，本实验着重进行GNCSCs的基础研究，为临床应用建立理论基础.

1材料和方法

1.1材料新生1，5 d昆明小白鼠，15只，体质量不拘，西安交通大学医学实验动物中心提供. ① DMEM/F12完全培养基（Gibco）组成：B27添加剂（Gibco），N2添加剂（Gibco），重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF， vitrogen)， β巯基乙醇（Sigma），青霉素和链霉素（华北制药）. ② 促分化培养基组成：DMEM/F12完全培养基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他：胰蛋白酶、Ⅳ胶原酶（Sigma），左旋多聚赖氨酸（Sigma）. 一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武汉博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗体(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗体（DAKO），鼠抗小鼠αActin单克隆抗体（Sigma）SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（博士得生物工程有限公司）. 二抗为TRITC标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉).

1.2方法

1.2.1取材、克隆球的培养颈椎脱臼法处死2组小鼠，将其肠管放入Hanks，清洗，机械分散肠管组织，胰蛋白酶和Ⅳ胶原酶分别消化肠管组织30 min，10 min，终止消化后反复吹打制成单细胞悬液，用200目，400目的滤网过滤，以800 r/min 离心 5 min，弃上清，用预先配置的无血清完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数活细胞，以 6×108个/L接种到25 mL培养瓶中，添加培养基至4 mL. 在37 ℃， 50 mL/ L CO2，饱和湿度培养箱中水平放置，贴壁培养. 原代孵育24 h后弃去漂浮的死细胞，以2/3量换液，孵育3 d后进行传代，以6×108个/L接种到25 mL培养瓶中，继续孵育40~48 h后再次传代，如有细胞团块形成则以1代/1~2 d的速度传代，3代之后可形成圆形的克隆球.

1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培养基重悬传代5次后的克隆球，接种于放置有预先包被左旋多聚赖氨酸盖玻片的35 mm培养皿内，每皿2 mL，动态观察克隆球的分化情况.

1.2.3克隆球及其分化细胞特异性标志物的染色应用p75NTR， GFAP， Peripherin，αActin抗体分别检测克隆球及其分化细胞系的性质，封片后分别用光学显微镜和激光共焦显微镜取图.

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2结果

2.1克隆球的生长状况接种初期，倒置显微镜下观察到单细胞和一些呈半球状或不规则的细胞团. 孵育24 h后，贴壁细胞胞呈圆形，胞体小，折光性好，部分贴壁细胞胞体增大，折光性增强，出现分裂相，形成2～5个细胞的细胞团，另一部分呈聚集生长. 3 d后形成十几或数十个细胞构成的克隆球(图1A)，克隆球增大的同时向周围伸出放射状的细胞索，形成较小的次级克隆，这些克隆球形态完整，折光性减弱，周边界线清晰，但其中心密集，界限不清，无法观察到完整的细胞结构 （图1B）. 重新传代培养，可观察到细胞胞体增大，出现分裂相的克隆球数量逐渐增多，杂质细胞减少，在连续传代过程中克隆球逐渐纯化.

2.2克隆球的分化接种含血清培养基12 h后，可见有细胞从克隆球中迁出，迁出的细胞贴壁生长；24 h后克隆球变扁，迁移出的细胞增多，相差显微镜下难以分别形态；48 h后贴壁细胞数量明显增加，逐渐形成单细胞层且细胞形态多元化.

2.3克隆球及其分化细胞系的免疫染色免疫细胞化学方法进行p75， Peripherin， GFAP， αActin免疫染色（图1C，图2， 3）.

3讨论

许多研究表明GNCSCs在ENS的发生和发育起关键作用［3-4］. 目前HSCR的病因与RET等8种基因密切相关［4-5］，在RET等基因缺失模型中， GNCSCs的生存、增殖、迁徙及分化等功能发生障碍，受累肠道的相应神经节出现缺失，表明先天性巨结肠可能是一种干细胞疾病. 由于HSCR及肠神经系统干细胞性疾病在手术治疗后仍遗留有严重的并发症，因此用干细胞来进行临床治疗已成为研究的热点和重点. 鉴于胚胎干细胞的来源限制及免疫排斥问题，成体GNCSCs的研究将为今后的移植试验提供新契机.

GNCSCs的培养方法建立在中枢神经干细胞的基础上. 依据神经干细胞经典的培养方法，再结合GNCSCs“收获率”低、难以分离纯化的特点，联合应用简化的特殊培养剂和神经干细胞培养方法进行体外培养. 连续传10代后，GNCSCs的相对比例明显增加，这种体外培养的方法能有效地分离和纯化GNCSCs，但并不能完全消除其他细胞. 如果继续传代，其纯化程度越高，后续的试验效果将更佳. 连续传代不仅纯化了GNCSCs，还证实了干细胞的自我更新特性. 在体外培养干细胞时，培养条件稍有变化可导致分化机制的启动，因此采用血清促分化法诱导GNCSCs分化既简单又可靠. 通过免疫染色，证实了GNCSCs分化细胞的类型，同时显示了分化的亚型神经元及神经胶质细胞的形态，并表明了成体干细胞的多向分化能力.

参考文献

［1］ 杨帆，杨树源. 神经干细胞研究进展及临床应用前景［J］.医学综述， 2002；8(8):491-493.

［2］ Newgreen D， Young HM. Enteric Nervous System: development and developmental disturbancespart2［J］. Pediatr Dev Pathol，2002， 5(4): 329-349.

篇2

目的 建立Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分离、培养的方法，并进行鉴定、标记。方法 采用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠的MSCs。采用相差显微镜观察MSCs的形态学特征；流式细胞仪检测第3代细胞表面标志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表达率；电镜检查第3代MSCs超微结构。DAPI标记MSCs为下一步进行体内细胞移植示踪。结果 原代培养的MSCs于6～8 h后贴壁，6 d左右形成集落，14 d 左右可达到80%～90%融合。第3代细胞表面标记物CD29，CD44，CD34和CD45的阳性率分别为98.6 %，78.2%，0.0%，0.3%。超微结构清晰，可见细胞器，如线粒体、粗面内质网和高尔基复合体，细胞核呈圆形或不规则，可见较多微绒毛。DAPI可良好标记MSCs细胞核，呈蓝色荧光。结论 采用全骨髓贴壁培养的方法能够成功分离和培养大鼠的MSCs，在第3代可获得高纯度MSCs。DAPI可以作为一种示踪剂标记MSCs。

【关键词】 细胞培养；间充质干细胞；种子细胞；示踪剂

【Abstract】 Objective To establish a method for isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) from Wistar rats in vitro，and to identify characteristic of the cells and to label them after culture expansion.Methods MSCs were isolated and cultivated from the bone marrow of Wistar rats by adherent method.The morphology of MSCs was observed under phase contrast microscope.The expression of CD29 ， CD44 ， CD34 and CD45 of the third generation cells were analyzed by flow cytometry. Electron microscopic features were also observed and MSCs were labeled by DAPI. Results After 6 to 8 h primary culture ， MSCs adhered to plastic surface of the culture dish. 　About 6 d later ， the cells proliferated in colonies.Primary MSCs reached 80%～90%of confluence in 14 d approximately.The positive rates of CD29 ， CD44 ， CD34 ， and CD45 in MSCs at third generation were 98.6% ，78.2% ，0.0% ， and 0.3% respectively. Under the electron microscope MSCs had plentiful cytoplasm with mitochondria rough endoplasmic reticula and Golgi complexes.Their nuclei were round or irregular and there were plenty of microvilli on the surface. All of the MSCs after labeling by DAPI showed blue fluorescence by fluoroscope.Conclusions Mesenchymal stem cells can be successfully isolated and cultivated by adherent method.And higher purity MSCs can be picked up after culture expansion at P3. DAPI can be an effective tracer agent to label MSCs.

【Key words】 Cell culture;Mesenchymal stem cells;Seed cells; Tracer agent

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的非造血干细胞，可以向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、干细胞、肌细胞、神经细胞以及心肌细胞分化〔1，2〕，具有高度可塑性，易于体外扩增，因其来源充足、取材方便，体外增殖能力相对较强，而且在异体移植中排斥反应小，被认为是组织工程和基因工程的理想种子细胞，为心血管疾病、神经疾病和骨关节疾病的治疗提供了一条全新的治疗方案。本文在总结贴壁分离法培养MSCs的基础上，优化MSCs纯化、鉴定、标记的方法，以获得稳定的培养体系，为应用组织工程技术提供大量的种子细胞。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级雄性Wistar大鼠(3周鼠龄，60～70 g)，吉林大学动物实验中心提供。

1.2 主要试剂和药品

低糖DMEM培养基(Gibco公司)，特级胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，亚美尼亚仓鼠抗大鼠CD29Alexa Fluor (Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD45过氧化物酶（FITC）(Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD44PE (Santa Cruz 公司)，小鼠抗大鼠CD34FITC(Santa Cruz公司)，46二脒基2苯基吲哚（DAPI）储存液(Sigma 公司)。

1.3 分离和培养

Wistar大鼠麻醉后处死，浸泡酒精15 min，无菌条件下分离股骨、胫骨，无血清DMEM冲洗骨髓腔，取混悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀含10%胎牛血清的DMEM混悬，将获得的细胞接种在100 ml培养瓶中，5% CO2，37℃下培养24～48 h，换液，去除未贴壁细胞，2～3 d更换一次培养基，光镜观察细胞融合情况，细胞80%融合后传代，0.25%胰酶消化，用血球计数仪计数细胞、传代，培养3～5代细胞。

1.4 透射电镜样品制备

将培养3代10 cm2培养皿中约2×106个细胞以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次，再以3 %戊二醛4℃固定1 h，送电镜室，脱水包埋并制作超薄切片，行透射电镜观察并拍照。

1.5 MSCs表面标记物检测

0.25%胰酶消化收获第3代细胞，收集1×106个细胞，洗涤1次，0～4℃预冷的70%乙醇1 ml边加入边摇匀，混匀后置于4℃冰箱待进行细胞表面标记物检测。检测时以1 ml PBS洗涤2次，加含10%山羊血清的 PBS常温孵育10 min，1 000 r/min离心5 min去上清，与饱和浓度的CD29Alexa Fluor、CD34FITC、CD44PE、CD45FITC单克隆抗体及其同型对照混匀，室温下闭光反应30 min，PBS 洗涤细胞，置于冰上，行流式细胞仪检测。

1.6 MSCs标记

将无菌的DAPI 储存液加入培养的MSCs爬片上清中，至终浓度为50 mg/L ，37 ℃孵育染色至少30 min。细胞至少用Hanks 平衡盐溶液冲洗6 遍以除去未结合的DAPI。荧光显微镜下观察细胞爬片。

2 结 果

2.1 MSCs相差显微镜观察细胞形态

骨髓细胞接种于培养瓶后，约6～8 h可见MSCs细胞贴壁，呈圆形或多角形，换液后，贴壁细胞清晰可见，2～3 d后可见少量短梭形、星形细胞分散贴壁生长，伸出伪足呈逗点状或短棒状；6 d左右可见放射状排列的细胞集落，伸出长短不一、粗细不均的突起、胞核大、核仁清晰。约14 d细胞融合80%～90%，呈漩涡状。传代细胞比原代细胞贴壁快，24 h内已全部贴壁、伸展，增殖迅速，均匀分布生长，3～4 d可见长梭形细胞80%～90%铺满培养皿形成单层。见图1。

2.3 MSCs的鉴定及标记

第3代细胞表面标记物CD29、CD44、CD34和CD45的阳性率分别为98.6 %、78.2%、0.0%、0.3%。见图3。细胞经DAPI标记后，细胞核呈蓝色。见图4。

3 讨 论

由于骨髓的细胞组成复杂，细胞功能各异，其中MSCs含量很低，约为骨髓低密度组分中有核细胞的0.001%～0.01%〔3〕，故分离高纯度的MSCs是原代培养关键性技术。目前，获得MSCs的方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠分选法〔4〕。而骨髓贴壁法操作步骤简单，既降低了离心对细胞的损害，又减少了污染机会，且分离的MSCs贴壁时间短，增殖快，细胞数量多，经传代后能够纯化，提示全骨髓贴壁法是一种更加简单有效的MSCs分离方法。

一般认为，间充质干细胞没有特异性表面抗原，整合素家族成员CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105等是MSCs的重要标志物〔5〕，而MSCs不表达造血细胞表面抗原，如造血前体细胞标志抗原CD34、成熟造血细胞标志抗原CD38、白细胞标志抗原CD45、淋巴细胞表面抗原CD11a和单核细胞/巨噬细胞表面抗原CD14。因此，实验选取MSCs表达阳性的指标CD29、CD44，以及表达阴性的指标CD34和CD45作为鉴定参考指标〔2，6〕。本研究选择了CD29、CD34、CD44和CD45进行检测，结果表明培养的细胞CD29和CD44阳性，CD34和CD45阴性，符合MSCs的特点，经过传代，第三代可获得较高纯度的MSCs，可以作为稳定的种子细胞进行体内研究。

DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。DAPI对活细胞无毒性，不改变细胞器的超微结构，荧光保持时间较长。移植细胞的标记是研究其在体内的定位不可缺少的，目前常用的标记法有DAPI标记法、溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记法、染色体标记法、基因标记法。BrdU法存在只能标记增殖期细胞，且标记细胞不能直接观察等不足。染色体标记主要将雄性供体动物细胞移植到雌性动物体内，通过Y染色体杂交区别确认移植细胞。其优点在于可以终生标记，但也存在操作繁琐，无法观察活细胞等不足。基因标记法通过基因转染或直接从转基因动物取材，使被标记细胞携带绿色荧光蛋白（GFP）暼报告基因。但目前，实现报告基因在目的细胞中高效稳定表达仍然存在程序繁琐、实验周期长、成功率低等困难，而从转基因动物取材又因为动物来源困难，在国内较少开展〔7〕。本研究表明，DAPI起初标记率很高(接近100%)，1 w内可维持80%～90%标记率。但随着标记时间的延长，其标记效率迅速下降，3 w以后绝大多数细胞失去标记。

本实验完善贴壁法建立Wistar大鼠MSCs培养体系，经鉴定细胞纯度高，可以为体内移植提供大量的种子细胞。采用DAPI 进行细胞标记后，荧光显微镜下见所有MSCs 均已被标记蓝色荧光，提示DAPI 标记法敏感性好，标记效率高，可应用进行体内细胞移植的良好标记。

参考文献

1 Gnecchi M.Melo LG.Bone marrowderived mesenchymal stem cells：Isolation，expansion，characterization，viral transduction，and production of conditioned medium〔J〕.Methods Mol Bol，2009;482:28194.

2 杨 丽，张荣华，谢厚杰，等.建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2009;13(6):10648.

3 Wakitani S，Saito T，Caplan AL.Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5azacytidine〔J〕.Muscle Nerve，1995;18:141726.

4 赖平平，韩春茂，岑航辉，等.骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学性状〔J〕.浙江医学，2004;26(5):32830.

篇3

自lichter等[1]1981年首次报道了甘蓝型油菜游离小孢子培养并成功获得了再生苗,在后来的20多年里,国内外学者已经成功地在甘蓝型油菜中建立了小孢子培养技术体系,特别是用此种方法从培育的dh群体中获得的多种油菜品种已经在生产中得到了广泛的认可。现将甘蓝型油菜小孢子加倍培养技术介绍如下。

1选取花蕾

一般在天气晴朗的8~10时取材,如遇阴雨天气,为了不影响试验进程也可取材,但一定要选取生长良好的花序,研究报道低温有利于小孢子的胚胎发生。尽量选取主花序或生长状态较好的花序,然后在实验室选取大小在2.5~3.5mm的花蕾备用。不同的材料花蕾的发育时期不尽相同,可以剥蕾挑取小孢子进行镜检以确定发育时期,最佳时期为单核晚期至二核期。花药为淡绿色呈透明状。取蕾以后如果不能立刻进行小孢子的提取,应将花蕾放置于湿润的条件下低温保存。

2游离小孢子分离

先用75%的医用酒精将花蕾表面灭菌30～60s,再用0.1%升汞消毒花蕾表面15min,再用无菌水冲漂洗3次,每次5min。将消毒的花蕾置于灭过菌的玻璃管中,加约2ml b5提取液,用灭菌玻璃棒将花蕾研碎,压出花粉小孢子,通过2层槽式无菌滤纸,或45μm的尼龙网,或0.22μm孔径的微孔滤膜过滤,把滤液倒入灭菌了的带盖的10ml离心管里,用滴管吸b5抽提培养液冲洗过滤器中的花粉,冲2~3次后,在10ml离心管中将花粉悬浮液稀释;将花粉悬浮液离心,800rpm,离心5min;将离心管中的上层清液吸去,再加液体b5抽提液,并将沉淀的花粉用吸管冲散,再次悬浮离心(用封口膜封口),1 800rpm,离心5min,吸去上层清液。

3小孢子加倍培养

将沉淀的花粉用nln-16 液体培养基稀释,稀释不要超过10ml,因为加倍后还要在10ml的离心管中再次稀释离心,倒入三角瓶在32℃条件下暗培养2d左右(48~72h);然后检查是否有污染,如果没有污染,则分皿继续培养。

4胚诱导培养

将加倍后的nln-16花粉悬浮液倒入离心管离心,800rpm,离心5min,倒掉nln-16液体;将沉淀的花粉用nln-13培养液稀释,稀释后的悬浮液分装入7.5cm培养皿,一般每皿加入悬浮液3ml左右,含花蕾1.5~2.0个/ml,小孢子密度为10~50万个/ml,用封口膜封口;将封口的培养皿在25℃的条件下进行暗培养,10d左右开始查看是否有可见的颗粒状胚,如果没有则继续培养[2]。

5胚状体培养

当肉眼可见的小胚状体出现时,把培养皿放在摇床上振荡暗培养5~7d,转速为80～100rpm。然后将鱼雷形、子叶形胚状体移植到b5固体培养基上,在25℃光暗交替条件下持续培养,诱导植株再生[3]。

6再生苗培养

培养1~2周后,见到子叶长大变绿,胚根伸长,长满白色根毛。继续培养后形成真叶,胚根不再伸长。当达到3～4片真叶时,再转移到生根培养基上生根,或在附加1mg/l 6-ba的b5培养基上进行扦插繁殖,获得完整植株。

7再生植株倍性鉴定

对再生植株进行细胞学鉴定(染色体数目)或在开花以后根据花器形态(雄蕊和花瓣形态)进行鉴定[4-7]。若是单倍体植株,需要再加倍培养成双倍体,可以把带有秋水仙碱溶液的脱脂棉盖在植株的顶芽、腋芽上;或者初花期把单倍体植株从土壤中取出,洗净根部泥土后用0.2%～0.4%秋水仙碱溶液泡1.5～8.0h,再移栽田间;或者胚状体再生获得的试管苗,在含10～100mg/l秋水仙碱的b5液体培养基中无菌培养4～8d,转到无秋水仙碱的b5培养基中培养7～14d,然后移栽到土壤中[8,9]。

8参考文献

[1] lichter r.introduction of haploid plants from isolated pollen of brassica napus l[j].zpflanzenphysiol,1982(105):427-434.

[2] 石淑稳,周永明,吴江生,等.

甘蓝型油菜小孢子培养、染色体加倍、试管苗继越夏和田间移栽配套技术的研究及其在油菜育种中的应用[j].中国农学通报,2001,17(2):57-59.

[3] 余凤群,刘后利.提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究[j].作物学报,1997,23(2):165-168.

[4] 祁永琼,林良斌.油菜小孢子再生体系的研究进展[j].云南农业大学学报,2003,18(2):208-211.

[5] 姜凤英,冯辉.羽衣甘蓝游离小孢子培养初报[j].园艺学报,2005,32(5):884.

[6] 石淑稳,吴江生,周永明,等.甘蓝型油菜小孢子单倍体二倍化技术的研究[j].中国油料作物学报,2002,24(1):1-5.

篇4

为此，在2010年，山东信得专门成立动物疫苗有限公司，并投资1.5亿元建成了国内首家大规模细胞悬浮培养工艺生产高致病性禽流感灭活疫苗的GMP车间，并于次年初通过了农业部的GMP动态验收，获得GMP证书和兽药生产许可证。2012年，山东信得获得农业部颁发的禽流感细胞苗新兽药证书。

“此次获得重组禽流感病毒（H5N1亚型）灭活疫苗的生产文号，标志着山东信得研发生产的产品将由此进入规模生产阶段，并能面向市场供应。”山东信得有关负责人表示，同时也说明了细胞悬浮培养技术已经打破多年来动物疫苗生产行业一直采用鸡胚生产禽流感疫苗的技术瓶颈，标志着我国在禽流感疫苗的研发和生产方面，已经走到了世界技术前沿，具有极大的引领和示范作用。

篇5

【关键词】 乙醇 肝细胞 原代培养 柴胡皂苷-d 保护作用 机制

随着人们生活水平的提高和饮酒量的增加，酒精对肝脏的损害日渐突出。了解酒精对肝损伤的机制，筛选有效预防和治疗酒精性肝损伤的药物应用于临床，是亟待解决的重要课题。目前，中药复方对酒精性肝损伤的实验研究和报道比较多，单味制剂报道较少。柴胡皂苷（saikosaponins SS）是中药柴胡的有效成分，根据其化学结构不同可分为柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d等，以柴胡皂苷d(SS-d)药理活性作用最强。整体水平研究表明柴胡皂苷对酒精性肝损伤有预防作用［1］。本文建立体外乙醇损伤肝细胞模型，在细胞水平上进一步研究柴胡有效成分SS-d对乙醇损伤肝细胞的保护作用机制。

1 器材与方法

1.1 药品与试剂 SS-d（纯度98%），昆明长春花科技有限公司提供，临用前以蒸馏水配制；Hanks液高压灭菌，4℃保存；1.0 g·L－1胰蛋白酶，用Hanks液溶解，过滤除菌，调pH 7.2，分装，-30℃保存；基础培养液，RPMI1640培养基10.0 g，用超净水900 ml溶解，5.6%NaHCO3调pH至7.2，定溶到1 000 ml，过滤除菌，临用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 U·ml－1，链霉素100 μg·ml－1，胰岛素5 μg·ml－1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-px测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 动物 SD大鼠，2～4 d龄乳鼠，雌雄不限，清洁级，承德医学院实验动物管理中心提供。

1.3 仪器 CO2培养箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自动生化分析仪（美国Bayer公司），721W微机型分光光度计（上海光学仪器五厂），离心机（TGL.16G 上海）。

1.4 肝细胞分离培养［2］取新生2～4 d大鼠30只，75%乙醇浸洗后断头放血，无菌分离肝脏，去除肝脏外膜及其周围结缔组织，置Hanks液中，灌注冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的组织块，用Hanks冲洗数次，除去血细胞，加入0.8g·L－1胰蛋白酶10 ml，37℃孵育12 min，加入数滴血清终止消化，用滴管轻吹打成细胞悬液，经200尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，1 000 r离心5 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>85%，按1 ×109个·L-1接种于铺有鼠尾胶原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2条件下培养24 h后更换培养液去除血细胞，继续培养72 h后进行分组实验。

1.5 乙醇诱导肝细胞损伤模型的建立将含肝细胞培养液的96孔板，设正常对照组及乙醇25，50，75，100 mmol ·L－14个剂量组，肝细胞悬液与不同浓度乙醇继续培养12 h，取培养液按赖氏法测定ALT活性，MTT法测定肝细胞存活率。

1．6 MTT法选择SS-d的实验浓度 SS-d初浓度为5 mg/L，采用细胞培养液进行稀释，依次为5.0 ，4.0，3.0 ，2.0 ，1.0 ，0.5 mg·L－1。将肝细胞接种于96孔板培养72 h更换培养液，换用SS-d稀释液培养，另设空白对照组，12 h后吸出培养液，各孔加入0.05%MTT200 μL，37℃孵育4 h，去上清液，各孔加入二甲基亚砜200 μl，混匀以溶解被还原的MTT结晶，检测波长为492 nm的光密度值，计算药物不同稀释浓度下细胞的存活率。

1.7 SS-d对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用取培养72 h肝细胞，设乙醇损伤模型组、SS-d(1 .0，2 .0，3.0mg·L－1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。模型组和SS-d组加入乙醇100 mmol·L－1，同时SS-d组加入不同浓度的SS-d，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养12 h，收集培养上清液检测ALT活性，收集肝细胞检测MDA含量和GSH-px的活性，MTT法测定肝细胞的存活率。

1.8 统计学处理 数据以 表示，用SPSS计算机软件进行统计学分析， 组间比较采用t检验，P

2 结果

2.1 乙醇对原代培养肝细胞的损伤不同浓度的乙醇作用于肝细胞，对细胞有剂量依赖性的损伤作用，25 mmol·L－1作用不明显，光镜下细胞形态基本正常，随着浓度的增大，肝细胞存活率呈进行性降低，反映肝细胞损伤的酶ALT逐渐升高；镜下观察肝细胞损伤明显，细胞结构不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol ·L－1乙醇作用最明显，我们选择乙醇浓度为100 mmol ·L－1制备肝细胞损伤模型。见表1。表1 不同浓度乙醇对肝细胞ALT水平及细胞存活率的影响 与空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

2.2 SS-d 实验浓度的选择SS-d不同浓度时细胞存活率见表2，为避免药物浓度过大所致的细胞毒性作用，应选择对细胞生长无明显影响即肝细胞存活率在90%以上的浓度(1.0 ，2.0 ，3.0 mg·L-1)作为实验所用药物浓度。见表2。表2 不同浓度SS-d对肝细胞存活率的影响与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

2.3 SS-d对乙醇损伤肝细胞的保护作用 100 mmol·L－1乙醇作用肝细胞后，肝细胞损伤明显，大量细胞坏死，细胞内ALT释放量明显升高，细胞内MDA含量明显增高，GSH-px活性明显下降；而给予SS-d保护后， 培养液中ALT水平明显降低；肝细胞MDA含量明显降低，GSH-px活性明显升高；并且肝细胞存活率明显升高。具有明显的剂量依赖性(P＜0.05，P＜0.01)。表明：SS-d能够保护肝细胞、稳定肝细胞膜的结构，其保护作用可能与抗脂质过氧化作用有关。见表3。表3 SS-d对乙醇损伤肝细胞ALT，MDA，GSH-px水平与对照组比较，*P＜0.01，与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

3 讨论

大量研究表明，乙醇对肝细胞损伤是通过自由基介导脂质过氧化作用进行的［3～5］。乙醇在肝脏代谢时产生大量自由基，自由基除直接损伤肝细胞外，可引起肝细胞膜发生脂质过氧化反应，使细胞膜和细胞器结构破坏，膜流动性失常，大量肝内酶（ALT，AST）释放入血，并可抑制抗氧化剂谷胱甘肽的合成，减弱抗氧化酶（GSH-px）的抗氧化能力，使肝细胞代谢紊乱，肝功能异常，肝细胞广泛脂肪样和空泡样变性，最终导致细胞肿胀死亡［6］。因此，清除自由基抑制脂质过氧化反应，才能保护肝细胞，恢复肝细胞结构和功能的完整性。

SS是柴胡的主要成分，研究表明，SS对实验性肝损伤具有明显的保护作用［7，8］。但对单体SS－d保肝作用研究报道较少。因此，我们利用乙醇制备体外肝细胞损伤模型，在细胞水平上对SS-d保肝作用机制进行探讨。本研究显示，模型组肝细胞培养液中ALT活性明显升高，肝细胞脂质过氧化反应产物MDA含量增加，GSH-px活性降低，细胞存活率明显下降，表明乙醇可引起肝细胞氧化损伤；给予SS－d保护后，和模型组比较，肝细胞培养液中ALT活性明显较低，MDA含量明显降低，GSH-px活性明显升高，肝细胞存活率亦有明显升高。提示，SS-d对乙醇损伤肝细胞有明显保护作用，其机制可能是：①SS-d能增强机体内抗氧化防御能力，抑制自由基的产生；②稳定肝细胞膜系统，提高膜结构的稳定性，促进肝细胞增殖，防止肝细胞损伤和坏死。

【参考文献】

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篇6

一、MDCK 细胞大规模培养技术

细胞的悬浮培养可谓是理想的大规模细胞培养方式，悬浮培养技术是在生物反应器中，在人工条件下，高效率大规模的培养动物细胞进而应用于生物制品生产的技术，可根据细胞的贴壁能力分为微载体悬浮培养方式和全悬浮培养方式。

1. 微载体悬浮培养。MDCK 细胞是从犬肾分离出来的一种贴壁依赖性上皮细胞，且它具有典型的“失巢凋亡”现象，即一种特殊的细胞程序死亡，是由于细胞与细胞外基质或相邻细胞脱离接触而诱发的，也就是说依靠传统的驯化方式或者单纯的用机械搅拌使MDCK 细胞悬浮生长难度相当大。Van Wezel 创立的微载体悬浮培养系统开创了细胞体外大规模培养的先河，更为准确的说是使贴壁细胞大规模培养成为现实。微载体悬浮培养是一种先进的贴壁细胞培养技术，其原理是将对细胞无害的颗粒加入到生物反应器的培养液中，作为载体，使细胞能在微载体表面附着生长，同时加以持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。反应器中使用微载体是一种可以提高细胞浓度的策略，其细胞密度可达1×107 cells/ml。

采用微载体培养MDCK 细胞，结合了悬浮培养与贴壁培养的优点，包括（1）细胞贴壁表面积大大增加，培养基利用充分，细胞密度增大。（2）微载体可在搅拌停止时沉降，便于将培养基与细胞分离。（3）与方瓶贴壁培养时的代谢变化不大，正常培养基可通用等等。

但是，目前生物反应器微载体培养研究只是单批次的培养，其消化放大培养依旧是难题。且微载体培养过程中一般添加了血清，给下游纯化带来了巨大压力。采用商业无血清培养基，会大大增加企业生产成本。因此，自主开发无血清培养基进行MDCK 细胞悬浮培养是目前的发展趋势。

2. 无血清单细胞悬浮培养。我们知道，生物制品生产尤其是细胞培养方法生产病毒疫苗的过程十分严谨。细胞培养需添加血清，可是血清的加入无疑给生产后期的除杂纯化等工艺带来难度，而且，流感病毒血凝素HA 可被宿主蛋白酶裂解为成熟的HA1 和HA2，能够介导病毒囊膜和靶细胞膜结合，病毒开始繁殖，而MDCK 细胞本身不具备裂解HA 的蛋白酶类，所以常常添加胰蛋白酶来提高病毒产量，但是，细胞培养中的血清恰好又可以中和胰蛋白酶，这种矛盾致使MDCK 无血清培养问题更亟需解决。目前，MDCK 无血清培养已经取得了很大的进展，基本思路是在基础培养基的基础上补加各种生物活性因子来替代血清，结合细胞生长所需成分，配制出无血清培养基， 能够支持MDCK 细胞正常生长增殖。一般常见的营养添加因子有：胰岛素，人转铁蛋白，氢化可的松等等，再经过对这些添加因子的添加量的优化，最终确定无血清培养基成分。

现在，已有MDCK 细胞商业用无血清培养基，它们的成功问世解决了这一大难题。通过直接法或间接法，即：原含血清培养贴壁细胞直接消化传代换成无血清培养基培养或逐步降低血清浓度直至降到无血清培养，使MDCK 细胞适应无血清培养基，生长状态优良且能正常增殖传代。

完成了MDCK 无血清培养后，MDCK 单细胞悬浮培养仍在研究当中，有文献报道，已有驯化成功的MDCK 悬浮细胞系，但就市场应用来看，是远远不够成熟的。现阶段，驯化MDCK 细胞在适应了无血清培养基培养的基础上，对其进行单细胞悬浮培养驯化方法主要有以下几种：（1）使用硅化方瓶培养：将细胞培养方瓶先用硅化剂处理，防止了细胞的贴壁，再通过调整培养基成分，使细胞增殖；（2）使用摇床或摇瓶体系，通过外力作用，防止细胞贴壁，再对细胞进行筛选，然后扩大培养。

二、 MDCK 细胞应用于流感病毒疫苗生产

采用细胞系培养流感病毒是目前最有前景的流感疫苗生产方法，市场销售的一些贴壁细胞系如Vero 细胞，MDCK 细胞是应用于流感疫苗研究最典型的哺乳动物细胞系，经研究，这些宿主细胞产生的病毒滴度高，大部分病毒繁殖效果好。此外，研究表明，从相应的细胞培养生产的疫苗免疫应答效果和用鸡胚生产的疫苗一样好。MDCK 细胞应用于流感疫苗生产有很多优点：MDCK细胞易培养、增殖快、易放大，感染流感病毒效率高，可高效扩增流感病毒；MDCK 细胞生产的疫苗可以应用于对鸡胚蛋白过敏的患者等等。在使用MDCK 贴壁细胞接流感病毒后，通常会有较高的细胞特异性产率；微载体悬浮培养的MDCK细胞，接流感病毒后，HA 滴度可以高达9log2（1∶512）；就已知实验室用驯化出MDCK 悬浮细胞系接流感病毒，得出的TCID50 值和HA 滴度都高于贴壁细胞系。且已有疫苗厂商如Solvay 制药公司采用无血清培养基、微载体技术制备出了MDCK细胞流感亚单位疫苗；诺华公司制备出了由MDCK 细胞培养生产的流感疫苗Optaflu。

三、展望

在过去十几年中，用动物细胞培养制备流感疫苗生产方式已经替代了传统的使用鸡胚生产方式。动物细胞培养生产流感疫苗的特征在于其灵活性和可扩展性，然而，贴壁细胞易培养但是却很难扩大生产量，而如果使用微载体提供生长表面又会大大增加其成本。所以要努力创建悬浮细胞系，特别是MDCK悬浮细胞系。

多年以来，监管部门督促行业设立无血清培养流程，以避免污染。

然而，许多市售培养基仍然需要添加物，以达到高细胞密度和最大产物产量。理想的情况是，在疫苗生产中应该使用不需添加另外的蛋白质等混合物的已知成分的培养基。这不仅会降低批次变化的风险也有利于病毒收获的下游处理。此外，疫苗生产过程可以被简化，可以直接接毒而不用更换培养基。

篇7

【中图分类号】R587.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0044-02

引言

研究表明，骨髓含有造血干细胞（hemopoietic stem cells， HSCs）、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells， EPCs）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等多种成体干细胞。EPCs主要分化为血管内皮细胞，有助于血管疾病组织的血管新生；而HSCs和MSCs均具有多向分化潜力的特点，研究表明，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）可分化为成骨、软骨、心肌、肌腱、上皮、内皮等几乎所有三胚层类型细胞的能力[1-3]，基于这个特性使BMMSCs成为了中药诱导、临床移植及一些分子生物学实验的种子细胞源。因此，本实验采用最简单普通贴壁培养法分离、培养大鼠BMMSCs，若能得到较为纯净BMMSCs，在节约了培养BMMSCs成本基础上，提供了一种既简单又能稳定获得纯净BMMSCs的方法，为相关的实验提供丰富的BMMSCs。

1 材料和方法

时间及地点：于2009-09/2011-02在遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室完成。材料：清洁级SD大鼠，购自第三军医大学大坪医院动物实验中心[许可证号：SCXK（渝）2007-0005]。本研究所采用的动物实验操作程序经遵义医学院实验动物伦理委员会审议批准。主要试剂：LG-DMEM ，Gibco（New York，USA）

实验方法：

大鼠BMMSCs的分离、培养：颈椎脱臼法处死2～3周龄SD大鼠，无菌条件下手术取下两侧完整股骨（连同肌肉），浸入0.1%新吉尔灭15 min；剥离股骨附着肌肉，并用含双抗的D-PBS反复清洗。剪开股骨两端，用D-PBS冲洗骨髓腔，收集含骨髓细胞的洗脱液，1000 g离心5 min，弃上清，细胞沉淀用含10% FBS的LG-DMEM培养基重悬浮，每只大鼠分离的骨髓细胞接种两个T25培养瓶，置37 °C、5% CO2饱和湿度培养箱培养。每2 d换液1次，同时洗脱未贴壁的血细胞，倒置相差显微镜下每日观察细胞生长情况并照相。当BMMSCs生长汇合度达60～70 %时，采用0.125%胰蛋白酶消化法，按2～5×105个/ml细胞密度进行传代培养。

篇8

研究结果发表在《组织工程》杂志中，文章详细阐述了帝国学院研究小组将胚胎干细胞变成软骨细胞的过程。这样，医生将可培养软骨细胞并将其移植到许多受损或患病的组织中，即使因运动产生的损伤也可用新的软骨取而代之，甚至是进行整容手术。

软骨（Cartilage）是骨间非常密集的结缔组织，允许关节之间进行平滑的移动。

文章的第一作者Archana Vats博士说：“利用干细胞培养软骨的技术在临床研究中具有巨大的应用价值。目前英国的老龄化问题越来越严重，长寿不可避免地成为备受关注的话题。在此之前，医生也能进行关节移植，却不能移植软骨。而更换软骨后就可以避免再对关节进行移植。”

研究人员在特定系统实验室的有盖培养皿中培养人类胚胎干细胞，进而促使其变成软骨细胞。与生长中的胚胎干细胞相比，在干细胞与软骨的混合物中存在较高含量的胶原质和软骨蛋白。

篇9

[中图分类号] R329 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）27-10-03

Studies on Specifity Detection of Transdifferentiation of Epidermal Stem Cell to Conjunctival Epithelium

MENG Fanjian1CHEN Jiaqi2

1.Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220, China；2.Zhongshan Ophthalmic Center, SUN Yat-sen University, Guangzhou 510060，China

[Abstract] Objective To detect the transdifferentiation epidermal stem cells using realtime RT-PCR, and to ensure the feasibility of stem cell treatment on ocular reconstruction. Methods The experimental group cells were co-cultured with the conjunctival epithelial cells as the feeder cells with setting the blank control group. The both groups were cultured for the same time, and after 1, 3, 5, 7 day（s） extracted the RNA and detected the expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 by real-time RT-PCR method. Results Since the third day there were expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 in the experimental group, and on the fifth and seventh day the expression increased significantly（P＜0.01）. Conclusion The transdifferentiation epidermal stem cells in this study possessed the same biological characteristics as the normal conjunctival epithelium.

[Key words] Epidermal stem cell; Conjunctival epithelium; Real-time RT-PCR

表皮干细胞为皮肤组织中的专能干细胞，是一种成年组织干细胞[1]，可增殖分化为表皮中各种细胞成分，保持皮肤正常的表皮结构。表皮干细胞的分化方式有两种：对称分裂和不对称分裂。前者分裂成两个和母细胞相同的子代干细胞；而后者则分裂成一个子代干细胞和一个与母细胞不同的短暂扩增细胞（TAC）[2]，TAC属定向祖细胞。近年来干细胞疗法已成为治疗多种疾病的新途径，可替代、修复、加强受损的组织或器官的功能[3]。本研究应用组织工程学技术将表皮干细胞体外定向诱导分化为结膜上皮细胞，通过对目的细胞生物特性的检测，探讨其在临床眼表结膜重建治疗中的应用前景。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1人皮肤材料包皮标本来自中山大学第一附属医院泌尿外科包皮环切术患者，无泌尿系统疾病感染，患者年龄18～30岁，所取包皮标本均得到患者知情同意。

1.1.2结膜组织取自尸体眼正常结膜组织。

1.1.3试剂和仪器PCR用Taq酶采用TaKaRa公司的Ex-Taq；荧光定量试剂盒：SYBR（R） premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）购自TaKaRa公司（美国）；TRIZOL® Reagent RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司（美国）；RNA提取反转录PCR试剂盒购自Promega公司（美国）；RoboCycler®Gradient Temperature Cycler PCR仪（Stratagene公司，美国）；MJ Research OpticonTM4荧光定量PCR仪（美国）。

1.2方法

1.2.1饲养细胞的培养取尸体眼结膜，用加有1×103U/mL青霉素不含钙镁的PBS缓冲液冲洗3遍，于无菌超净台剪除结膜下筋膜组织，将其上皮面向上平铺于无菌培养皿中，加0.25% Dispase Ⅱ，置于37℃消化2h，弃去消化液并用无菌虹膜恢复器刮取上皮组织，并加入0.25%胰酶及0.02% EDTA消化约20min，待倒置显微镜下见到上皮细胞充分消化为多个单细胞状态时加入上皮细胞培养液中止消化，收集细胞悬浮液，置于离心管内，以1500r/min离心5min，获得消化的结膜上皮细胞，将其调整为1×104个/mL，在6孔Transwell培养板insert池中加入1mL结膜上皮细胞悬液饲养细胞组为实验组，对照组insert池中无饲养细胞，仅为相同体积的上皮细胞培养液。

1.2.2表皮干细胞的分离、筛选、培养取无菌手术获得的包皮皮片，用加有1×103U/mL青霉素不含钙镁的PBS缓冲液冲洗3遍后用含有1×103U/mL青霉素、2.5mg/L两性霉素不含钙镁的PBS缓冲液浸泡30min，无菌超净台剪除皮下组织，并剪成2mm×4mm皮条，浸泡于0.25% Dispase Ⅱ，置于4℃过夜。次日用眼科镊撕取表皮皮片，D-Hank’s液冲洗3次，并用眼科显微剪将其剪成1mm×1mm碎片，加入0.25%胰酶，37℃消化5～10min，用滴管吹打使细胞脱落，加入上皮细胞培养液中止消化，200目细胞筛过滤得细胞悬液，收集细胞悬浮液置于离心管内，以1500r/min离心5min，获得消化所得的皮肤上皮细胞。将其以1×106个/mL密度接种于Ⅳ型胶原（100μg/mL）铺底的培养瓶置于5% CO2、37℃细胞培养箱中待细胞贴壁20min后，去除未贴壁细胞，加入新的上皮细胞培养液，5% CO2、37℃细胞培养箱培养，1～2d换液一次。

1.2.3表皮干细胞与结膜上皮细胞共培养的诱导分化取1～2代表皮干细胞作为实验细胞，以5×106个/mL接种于6孔Transwell培养板中，实验组insert池中加入1mL结膜上皮细胞（细胞浓度为1×104个/mL）作为饲养细胞；对照组insert池中仅为相同体积的上皮细胞培养液，5% CO2、37℃细胞培养箱培养1、3、5、7d后，弃细胞培养液，分别取对照组和实验组细胞提取RNA，进行实时定量RT-PCR检测目的基因β2-微球蛋白、角蛋白K13的表达情况。

1.2.4细胞总RNA的提取吸出6孔Transwell培养板中的培养液，每孔加入1mL TRIZOL® Reagent，振荡混匀，15～30℃温育5min，每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，振荡15s，然后于15～30℃放置2～3min，于2～8℃离心样品15min（＜12 000g），将上层水相移至新管中，每1mL原始Trizol用量加入0.5mL异丙醇，室温放置10min，4℃离心（＜12 000g），弃上清，每1mL Trizol用量用1mL 75%乙醇洗涤，振荡样品，然后7 500g离心样品5min（如果用来富集小分子RNA，则不用75%乙醇洗涤，直接进入下一步），空气干燥RNA 10min，用适量RNase free水溶解，于60℃温育10min，置于-80℃备用。

1.2.5引物的构建按照参考文献[4]构建设计：β-actin正向引物：5’-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3’，β-actin反向引物：5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3’；β2M正向引物：5’-GAATTGCTATGTGTCTGGGT-3’，β2M反向引物：5’-CATCTTCAAACCTCCATGATG-3’；CK13正向引物：5’-GAGGAATGGTTCCACGCCAAG-3’，CK13反向引物：5’-GCGACCAGAGGCATTAGAGGT-3’。

1.2.6PCR扩增取3μL逆转录反应产物做模板，根据试验目的加入相应的正向引物和反向引物。PCR反应总体系为20μL。条件为95℃ 5min，1个循环；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，共30个循环；72℃ 10min，1个循环。

1.2.7荧光定量PCR按照SYBR（R）Premix Ex TaqTM试剂盒的说明书进行。取1μL逆转录反应产物做模板，20μL反应体系，引物浓度为10nM/μL，各加入0.5μL。SYBR（R）Premix Ex TaqTM 10μL，用双蒸水补平至20μL。反应程序为94℃ 10s，1个循环；94℃ 5s，58℃ 31s，读板，40个循环。数据分析采用2-CT方法。

2结果

Realtime RT-PCR的结果见图1、图2。结果可见实验组表皮干细胞5d及7d后β2-微球蛋白mRNA的表达明显上调，分别为（300±26）%（P＜0.01）、（300±13）%（P＜0.01）；CK13 mRNA表达上调（480±110）%（P＜0.01）、（760±53）%（P＜0.01）。与对照组相比，β2-微球蛋白mRNA及CK13 mRNA表达都有显著性上调。

图1表皮干细胞中β2-微球蛋白mRNA的表达水平5d实验组细胞中β2-微球蛋白mRNA表达上调（300±26）%（P＜0.01）；7d实验组细胞中β2-微球蛋白mRNA表达上调（300±13）%（P＜0.01），其中n=5，6

图2表皮干细胞中CK13 mRNA的表达水平5d实验组细胞中CK13 mRNA表达上调（480±110）%（P＜0.01）；7d实验组细胞中CK13 mRNA表达上调（760±53）%（P＜0.01），其中n=5，6

3讨论

角蛋白（keratin）是上皮细胞异性的中间丝成分。已知的细胞中表达的各种角蛋白家族亚单位成员具有组织特异性，并且和细胞的分化相关[5]。例如：Krenzer等[6]报道：在正常结膜上皮细胞中表达角蛋白K13/K4/K8/K19/K7。Dota等[7]研究报道：通过对38例正常结膜组织的上皮细胞建立的cDNA文库，检测出角蛋白K13是结膜细胞转录中表达最丰富的基因，且该基因与细胞骨架的合成有关，并认为K13有可能是有关眼表结膜细胞分化最敏感的基因。而且早期的研究中也证明：在结膜上皮细胞的免疫组化鉴定中结膜上皮细胞可被特异性角蛋白K13抗体标记，而在皮肤干细胞中并无相应抗体的表达[8]。

β2-微球蛋白（beta-2-microglobulin）是HLA抗原的成分之一。虽然有关该种蛋白的功能尚未明确，但是该蛋白存在于泪液中并可能来源于结膜上皮细胞中。并且在正常状态下泪液中的β2-微球蛋白浓度明显高于炎症时泪液中浓度。Dota等[7]研究中也同时检测到β2-微球蛋白也是结膜上皮细胞转录较高的基因，因此本研究将CK13和β2-微球蛋白作为结膜上皮细胞标记性（特异性）的高效表达基因。

近年来，相关文献[9-11]报告了通过组织工程技术将成体干细胞体外合成生物替代品，并对其组织功能改良用于眼表重建的临床治疗新技术。然而，成功的眼表重建依赖于两个重要因素。其一，具有高分化、高增殖能力的干细胞；其二，干细胞的载体组织。本研究中应用具有高分化、高增殖能力的表皮干细胞为种子细胞，从而保证眼表重建治疗中能获得可靠的细胞源。我们早期的相关研究中[4]报告应用同源异体的结膜去细胞基质膜为干细胞载体膜，不仅可保证具有良好的组织相容性，而且也确保在体外模拟形成结膜上皮细胞增殖的组织微环境。从而诱导表皮干细胞定向分化、增殖。

研究结果显示经诱导分化的表皮干细胞在短时间内具有结膜上皮细胞的特异性基因CK13及β2-微球蛋白的高表达，提示该实验方法可诱导表皮干细胞形成特异性短暂扩增细胞（TAC），并能定向分化为类结膜上皮细胞。因此，在临床上眼表重建的干细胞疗法应用中，该方法不仅可保证获得充足的目的细胞来源，而且确保目的细胞具有稳定的生物学特性。在眼表结膜组织的重建及生理功能恢复的临床治疗中提供有效的组织来源。但是，该研究方法中诱导分化的表皮干细胞作为种子细胞能否合成人工结膜生物膜活体动物眼表的存活状况及生理功能重塑方面的问题，还需要进一步的研究探索。

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篇10

0 引言

目前，临床上普遍使用造血干细胞移植，用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海贫血等病的治疗。造血干细胞的主要来源是脐带血、骨髓。如果直接进行骨髓移植，则需要进行人体的白细胞抗原配型，否则发生免疫排异会危及患者生命。现有脐带血库储存的造血干细胞免疫原性弱，但数量供不应求，使其在疾病中的临床应用中受到限制。随着诱导性多能干细胞（IPS）提取技术的出现，使分化自身细胞变为了现实，不但避免了伦理问题，解决了免疫排斥问题，造血干细胞的数量也能满足临床需求。下面将分化研究过程报道如下：

1 材料和方法

1.1细胞株的来源

小鼠骨髓基质细胞OP9购于美国ATCC，诱导性多能干细胞IPS由中科院广州生物医药与健康研究院提供。

1.2试剂和仪器

小鼠骨髓基质细胞OP9的培养基为α-MEM，内含20%的胎牛血清，OP9细胞诱导干细胞分化培养基为α-MEM（15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明胶），CD34来自MACS公司。抗体为APS-TRA-1-85，半固体培养基购于SCT公司。流式细胞仪为美国AccuriC6型，定量PCR仪为CFX96型。

1.3方法

在六孔板中先铺好1%的metrigel进行细胞培养，每三天添加0.5mmol/L的EDTA，以保持对照组细胞的未分化状态，OP9用细胞培养液培养，培养时放在大小为10cm且铺有0.1%的明胶的盘里，，每隔四天用胰酶消化传代。细胞培养温度为37℃，CO2浓度为0.5，湿度饱和。

OP9细胞进行传代培养4天后，将OP9的培养液换成诱导干细胞分化的培养液，将UC013细胞洗两遍后，再对边缘部位细胞进行消化，将细胞吸出后加入Dispace，再用枪头吹吸混匀细胞后，将其转移到加有分化培养液的细胞盘中摇匀，在与上述培养的温度、空气CO2浓度和湿度相同的条件下进行培养，培养的第二天将培养液换为共培养液，第四天开始每隔一天半换一次培养液，第九天收样品。

免疫磁珠法分选CD34+细胞，将细胞用PBS洗两遍，接着用胰蛋白酶进行消化，制备单细胞悬液，再将细胞收集到离心管中进行离心，收集沉淀，再向其中加入2%血清吹打均匀。过滤后，向其中加入FCR和 CD34标记细胞，30秒后加入流式细胞缓冲液，再离心，然后吸取上清，加入流式细胞缓冲液重悬。将制备好的细胞悬液加入流式细胞仪进行分离，通过流式细胞仪分离柱的CD34-细胞被移出分离柱弃之，最终，通过加压洗脱分离柱上黏附的细胞，即得到CD34+细胞。

用流式细胞术进行检测，将共培养9天后的细胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后，制备单细胞悬液，收集到离心管中，静置五秒后，用加有2%血清的流式缓冲液重悬，细胞过滤后，加入FCR和抗体，孵育15min，再用流式缓冲液清洗，重悬，最后用流式细胞仪进行检测。

集落形成实验。将分选的CD34+细胞接种到半固体培养基中，放于培养皿中进行培养，每孔接种1万个细胞，培养14-16天。然后，在显微镜下根据集落成的血细胞形成特征，对集落细胞进行分类和计数。同时，提取共培养2、4、6、8、10和12天的细胞的RNA，用RT-PCR法检测各基因在细胞中的相对表达量。

2 结果

2.1细胞培养与观察

观察培养的细胞，结果显示，对照组未分化的人体细胞集落状生长，呈扁平状，排列紧密，没有分化的迹象。实验组培养2天后的细胞，表面布满细胞集落，已进行造血干细胞分化。OP9细胞贴着细胞壁生长，细胞为三角形，周围向外出伸出像纤维状的伪足，细胞排列规则，生长迅速，培养4天后细胞铺满了培养皿底。

2.2诱导造血干细胞分化

通过在本实验组的诱导分化条件下，对实验组和对照组细胞的培养，实验组细胞分化到一定程度后，便开始大量克隆，细胞的形态也发生了分化，接着，OP9细胞开始出现老化迹象。

2.3流式细胞术检测

共培养9天后用流式细胞仪检测细胞造血表面标志物表达情况，用流式细胞仪分析培养细胞的CD34、CD43、CD31的表达情况，结果显示表达上述表面标志物的细胞分别占有比例为20%、2%和7.1%。

2.4 4RT-PCR检测

运用RT-PCR对共培养的细胞进行基因表达检测，结果显示，IPS细胞发生造血分化时，Oct-4基因的表达慢慢消失；造血转录因子基因表达缓慢升高；Runx-1基因在造血干细胞分化12天当中的表达呈波浪式变化，其中分化第二天表达量最高，第四天开始下降，第八天开始升高；CD34在造血分化过程中的基因表达量逐渐增高。

2.5 CD34+细胞集落实验

CD34+细胞在半固体培养基中进行培养，根据造血干细胞的形态特征，对细胞集落进行分类和计数。结果显示，红系集落（CFU-E）、粒系集落（CFU-G）、巨核系集落（CFU-M）、粒―巨核系集落（CFU-GM）集落数量持续升高，混合系集落（CFU-GEMM）的集落数量逐渐降至最低。

3 讨论

随着干细胞技术的发展，通过诱导分化得到造血干细胞已经成为事实。相对于多能干细胞而言，IPS通过导入转录因子以及重编程进行定向分化的比例较低，，但是IPS的获得方法比较简单稳定，避免了胚胎干细胞面临的伦理和法律等问题，使IPS可以应用于细胞替代性治疗，并可以进行疾病的机理研究和肿瘤治疗药物的筛选。IPS细胞分化得到的造血干细胞免疫原性较低，解决了移植排斥的问题。

在本文的研究中，没有外加细胞因子，直接将IPS细胞诱导分化为造血干细胞，结果获得了20%的CD34+细胞，即造血干细胞，CD34是表达于造血干细胞的表面标志物，表明IPS可以分化为造血干细胞，但是转化率比较低。Runx1是调控造血干细胞分化的转录因子，期基因的表达量在分化过程中呈现波浪式的变化，Gata-2的表达则逐渐升高。体外分化得到的造血干细胞在半固体培养基中成集落状态，说明IPS可以向各细胞系进行分化。

现在多能干细胞分化为造血干细胞的方法主要有：一是形成胚状体后再进行诱导生成造血干细胞；二是基质细胞与多能干细胞共培养；三是形成EB后与OP9进行共培养；四是单层诱导ESC生成造血干细胞。利用OP9细胞与胚胎干细胞共培养，可以模拟体内的造血微环境，为研究细胞定向分化为造血干细胞创造了可能性，OP9细胞主要支持早期的造血干细胞分化，并协助B淋巴细胞增殖。基质细胞通过释放的细胞因子支持造血干细胞的分化。这种诱导方法分化时间短，为临床造血干细胞的移植提供了便利。诱导分化过程中不用添加细胞因子，比较经济。但该诱导方法也存在着一定的缺点，即存在鼠源性污染细胞的可能性，加之所用血清的成分的不明确性，限制了其在临床应用。

目前临床上移植造血干细胞主要是用脐血和骨髓来源的造血干细胞，而体外分化和扩增得到造血干细胞只能通过动物试验来获得。将造血干细胞植入重建小鼠体内，可以评价造血干细胞的功能。体外分化获得的造血干细胞和脐血中的造血干细胞与重建小鼠体内造血系统差异较大，需要进一步优化体外诱导多能干细胞分化为造血干细胞的过程，才能满足该实验需求

4 小结

通过将IPS定向分化为造血干细胞的研究，成功诱导了造血干细胞，分化得到的细胞在体外培养中形成了所需的各系集落，本文的研究所采用的技术方法希望可以为IPS细胞在造血疾病中的应用提供一定的实验依据。

参考文献：