时间:2023-08-01 16:54:53
导言:作为写作爱好者,不可错过为您精心挑选的10篇分子遗传学综述,它们将为您的写作提供全新的视角,我们衷心期待您的阅读,并希望这些内容能为您提供灵感和参考。
中图分类号:G642.0 文献标识码:C DOI:10.3969/j.issn.1672-8181.2013.23.150
动物遗传学是动物科学专业的重要专业基础课程。遗传学具有基础理论抽象、逻辑思维强、知识面涵盖广等特点,是动物育种的理论基础。遗传学的基本概念和原理来自于生产、生活和科学研究的实践,遗传学实验是遗传学教学中重要的环节,是理论教学的深化和补充。近些年,随着遗传学的不断发展,取得了很多的进展,特别是随着分子生物学的发展,遗传学进入了全新的分子遗传学时代,较之之前的形态遗传学、细胞遗传学而言,分子遗传学更为抽象,因此,长期沿用下来的经典遗传学实验显然已经不能满足遗传学快速发展的需求,从而对遗传学相关实验课提出了更高的要求。
针对以上情况,结合我校动物科学专业设置的实际情况,经过长期的摸索和创新,我校动物科学学院近年来开始开设了实用遗传检测技术课程,学时120学时。主要通过实验制备和观察,使学生从细胞、分子及群体水平上掌握遗传学的实验操作方法;学会基本仪器设备的使用技巧;了解遗传学研究方法和手段,进一步加强学生独立分析问题和解决问题的能力,独立操作和创新能力及培养学生的动手能力。同时注意培养学生实事求是,严肃认真的科学操作和良好的实验习惯,为今后的工作和研究打下良好基础。本文将就本课程的设置进行综述,旨在为相关学科今后在遗传学相关实验课程的开设方面提供借鉴。
1 细胞遗传学篇
细胞遗传学是研究细胞中染色体遗传规律的学科。 同时也是在细胞层次上进行遗传学研究的遗传学分支学科。着重研究细胞中染色体的起源、组成、变化、行为和传递等机制及其生物学效应。
围绕细胞遗传学,设立了如下实验项目:①细胞培养。主要讲解细胞的体外培养原理、条件、技巧和注意事项。主要通过采集动物外周血培养2个周期,用以观察培养细胞在体外分裂情况;②培养细胞的同步化处理。主要讲解在体外培养条件下同步化处理的原理、条件、技巧和注意事项。处理培养细胞分裂中期同步化;③外周血淋巴细胞染色体标本制作。主要包括以下过程:收集细胞低渗处理固定涂片染色观察;④骨髓细胞染色体标本的制备。主要包括以下过程:秋水仙素处理取管状骨冲取骨髓细胞低渗处理固定涂片染色观察;⑤果蝇唾液腺染色体标本的制备。主要包括以下过程:培养果蝇三龄幼虫解剖分离唾液腺水解处理染色压片观察;⑥染色体显G带。主要包括以下过程:制备染色体标本片胰蛋白酶处理染色观察;⑦各种显微镜的调试实用实践。主要包括熟悉普通研究显微镜,相差显微镜,暗场显微镜,荧光显微镜的光路合轴、聚光器调焦、滤镜选用等操作;⑧染色体标本的观察照相。主要包括以下过程:显微镜下观察制备好的染色体标本片统计分裂相的比例数细胞染色体数选形态良好数目占众数的分裂相拍照;⑨染色体核型分析。主要包括以下过程:染色体照片photoshop软件裁剪整理同源染色体配对排序测染色体臂长计算相对长度和臂比。
2 分子遗传学篇
随着遗传学的迅猛发展,分子遗传学已经渗透到了遗传学的各个角度,分子遗传学也因此在教学中已经占有了相当大的比重。分子遗传学实验技术也成为研究者使用得最多的分析手段,这就进一步要求我们的实验教学也要适应遗传学的发展。
围绕分子遗传学,设立了如下实验项目:①动物组织(肌肉)中DNA的提取。主要包括以下过程:采集动物组织材料破坏细胞膜和核膜白和DNA分离抽提纯化DNA乙醇沉淀DNA检测DNA纯度和量;②动物性别鉴定。主要包括以下过程:提取动物组织DNAsry特异引物PCR扩增电泳判断;③DNA酶切电泳。主要包括以下过程:λDNA限制性内切酶酶切琼脂糖凝胶电泳检测;④动物来源物种鉴定。主要包括以下过程:样品采集基因组DNA提取PCR-RFLP琼脂糖凝胶电泳检测判断;⑤动物组织总RNA的提取。主要包括以下过程:样品采集RNA提取琼脂糖凝胶电泳检测;⑥Total RNA质量的检测及cDNA的制备。主要包括以下过程:紫外分光光度计检测Total RNA质量反转录cDNA检测;⑦microRNA指纹图谱技术(MTFP)在肉品质检测中的应用。主要包括以下过程:样品采集总RNA提取及检测cDNA的制备及检测PCR反应及检测PAGE电泳检测和分析;⑧PCR-RFLP鉴定ABO基因型。主要包括以下过程:毛囊(毛发)中总DNA的提取及电泳检测糖基转移酶基因片段扩增及电泳检测扩增片段限制性酶切及电泳检测。
遗传学是研究生物遗传和变异的科学。随着现代生物科学技术的发展,遗传学已成为生命科学领域中发展最为迅速的基础学科之一,而实验实践教学环节为培养学生的科学思维、探索思维和实践创新能力提供重要途径,并且可以提高学生的实际动手能力和分析问题、解决问题的能力。遗传学实验技术和方法是遗传学建立和发展的基础,如今现代的遗传学实验技术已广泛渗透到生命科学的各个分支领域,并正在发挥其独特的作用。本文通过数名长期工作在遗传学本科教学一线的教师多年的教学实践经验,结合动物科学专业设置的特色,摸索了一套适合动物科学专业本科生实际的实验课教学体系,旨在为培养理论与实践兼备的高素质动物科学方向的本科生做出一定的贡献,也期望为国内同行遗传学教学相关实验课的开设提供一定的借鉴作用。
参考文献:
[1]郭玉华,曹敏建,曹秀云等.农业高校遗传课印证实践教学的新探索[J].高等农业教育,2003,(6):73-75.
[2]李婉涛,王文静.遗传学教学中学生创新能力的培养[J].高等农业教育,2003,(6):61-62.
[3]易乐飞,王萍,程汉良等.遗传学实验教学改革与创新型人才培养[J].中国现代教育装备,2011,(3):93-94.
[4]闫绍鹏,王秋玉,王晶英.遗传学实验教学改革的思考与实践[J].实验室研究与探索,2010,29(7):275-277.
[5]杨友才,刘目前,王水莲.加强实践教学,提高人才培养质量[J].高等农业教育,2003,(4):81-83.
[6]任大明,吕淑霞,张立军等.改革生物技术专业实验课教学模式的探索与实践[J].高等农业教育,2003,(5):60-61.
作者简介:苏蕊,内蒙古农业大学动科院,内蒙古呼和浩特 010018
中图分类号 S522 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2017)10-0039-02
Abstract Vigna radiata L. is an important economic crop used in medical and food industry.Breeding methods on Vigna radiata L. and genetic research progress were described.New ways and thoughts for reference were in prospect in this paper,including exploring of Vigna radiata L. germplasm resources and strengthenning of the Vigna radiata L. genetic studies. It provided theoretical basis and technical support for Vigna radiata L. breeding and genetic research,in order to improve the level of domestic Vigna radiata L. breeding and genetic research.
Key words Vigna radiata L.;breeding;molecular genetics;prospect
绿豆(Vigna radiata L.)属于豆科,别名青小豆,因其颜色青绿而得名。绿豆在中国主要产区集中在黄河、淮河流域的平原地区[1],生产经历了高―低―高的发展历程。绿豆营养丰富,可药食兼用,又是食品工业的重要原料,有“食中佳品,济世长谷”之称[2]。
1 绿豆育种研究进展
1.1 绿豆种质资源的收集与评价
种质资源是农业生产、新品种选育、遗传研究及生理生化研究的重要物质基础。目前,全球收集和保存的绿豆种质资源共有3万余份,世界上最大的收集和保存机构为亚洲蔬菜研究与发展中心亚洲区域中心[3]。1978年起,中国绿豆种质资源的搜集、农艺性状鉴定和整理、保存被正式列入国家重点研究项目。由中国农业科学院作物品种资源研究所组织各省、市、区的有关科研单位开展了绿豆种质资源的收集、鉴定、保存和利用,从20多个省(市、自治区)共收集绿豆资源6 000余份,完成了逾5 600份品种农艺性状的鉴定,并列入《中国食用豆类品种资源目录》[4-5]。种质资源的收集是育种及资源深入研究的基础。亚洲蔬菜研究与发展中心亚洲区域中心对收集的绿豆种质资源的进行分析与鉴定后,筛选出一批抗虫、抗逆、农艺性状较好的优质资源[3]。中国对2 200余份资源进行了抗病虫、抗逆性鉴定及品质分析[6],建立了资源评价数据库,为绿豆品种选育时亲本的选择提供了参考[7-8]。
1.2 绿豆育种研究概况
G豆新品种的选育主要采用系统选育、引种、杂交及诱变等常规方法。通过对地方绿豆品种资源的评价与鉴定,保留适合品种,并大面积推广,这些鉴定的新品系有效地解决了当地绿豆育种及生产中存在的问题,如印度的抗病品系和高蛋白品系。引进的品种可直接鉴定后进行种植,如从AVRDC引进的中绿1号、中绿2号等,对中国绿豆生产起到了极大的推动作用;引种还可丰富杂交亲本的遗传基础,提高品种的综合品质,许多育成的新品种都是由引进品种和地方品种杂交而来,如韩国裂叶品种Samgang、小粒品种Soseon[9-10],巴基斯坦高产品种Ramzan[11],中国品种豫绿2号、豫绿4号、冀绿9239、冀绿2号、潍绿1号等品种[12-14],这些育成的新品种已成为当地的主栽品种。绿豆属于自花授粉作物,人工杂交成功率较低,诱变育种是继系统选育和杂交育种之后发展起来的一项新技术。1996年,中国学者对绿豆进行了空间诱变研究,获得了一批稳定的绿豆变异品系[15],科研人员利用γ射线诱变培育的晋绿豆2号适应性广且产量高[16],Khan等[17]利用SA(叠氮化钠)诱变出的绿豆生育期显著缩短,后代群体产生了广泛的变异。
2 绿豆分子遗传学研究
2.1 绿豆分子标记及遗传图谱的研究
分子标记方面,由于前期绿豆分子遗传学研究比较落后,RAPD、AFLP 等常用标记方法应用比较频繁,但RAPD技术不稳定,且RAPD和AFLP技术繁琐且费用昂贵。因此,随着技术的开发,基于PCR技术的标记技术应用越来越多,如SSR分子标记技术。Kumar等[18]利用锚定PCR技术开发的SSR引物在绿豆基因组及绿豆近缘种中都能扩增出特异性条带,故这些开发的引物也可用于亲缘关系分析及近缘种间的比较作图研究。孙 蕾等[19]为了找到与抗豆象基因连锁的分子标记,利用63个RAPD标记和113个SSR/STS标记分析群体,共找到了22个与抗性基因连锁的分子标记。绿豆遗传连锁图谱的构建及目标基因的定位将有效缩短育种周期,为基因精细定位、基因克隆及分子定向修饰育种等奠定基础。如Lambrides等[20]利用抗豆象野生种ACC41及栽培种Berkern后代群体构建了2个绿豆遗传连锁图谱。
2.2 绿豆相关基因克隆研究进展
目前,绿豆基因克隆及研究工作已起步,但对绿豆转基因的研究还不成熟。缪建锟等[21]利用绿豆叶片扩增出362 bp的绿豆防御素基因,对其进行序列比对后将其构建到植物表达载体中进行遗传转化分析。Chen等[22]分离了绿豆Hsc70的cDNA,并在转录和翻译水平检查了其表达水平,该基因属于组成型表达基因,主要在生长发育过程中起作用。
3 展望
绿豆已成为我国种植结构调整及农民脱贫致富的重要经济作物,国家已把绿豆列入现代农业产业技术体系中,绿豆的育种研究也取得了显著成效,但从近年来新品种选育情况来看,资源利用率还比较低,一些潜在的优异资源还没有被发掘出来。应继续加强绿豆种质资源挖掘力度,继续搜集和鉴定资源的遗传多样性,为绿豆育种提供特征明确的优良种质[23-24]。
4 参考文献
[1] 林汝法,柴岩,廖琴,等.中国小杂粮[M].北京:中国农业出版社,2002:192-209.
[2] 郑卓杰.中国食用豆类学[M].北京:中国农业出版社,1997:141-166.
[3] 王丽侠,程须珍,王素华.绿豆种质资源、育种及遗传研究进展[J].中国农业科学,2009(5):1519-1527.
[4] 王丽侠,程须珍,王素华.绿豆种质资源、育种及遗传研究进展[J].中国农业科学,2009,42(5):1519-1527.
[5] 曹广才.黄土高原食用豆类种植[M].北京:中国农业出版社,2016.
[6] 程须珍,王素华,田静,等.绿豆优异种质综合评价[J].中国农业科学,1999(增刊1):36-39.
[7] 胡家蓬,王佩芝,程须珍.中国食用豆类优异资源[M].北京:中国农业出版社,1998.
[8] 刘长友,程须珍,王素华,等.用于绿豆种质资源遗传多样性分析的SSR及STS引物的筛选[J].植物遗传资源学报,2007,8(3):298-302.
[9] LEE Y S,LEE J Y,KIM D K,et al.A new high-yielding mungbean cultivar,"Samgang" with lobed leaflet[J].Korean Journal of Breeding,2004,36(3):183-184.
[10] KIM D K,LEE Y S,LEE J Y,et al.A new high-yielding mungbean cultivar,"Soseon" suitable for sprout with small seed[J].Korean Journal of Breeding,2004,36(5):383-384.
[11] KHATTAK G S S,ASHRAF M,SAEED I,et al.A new high yielding mungbean(Vigna radiata(L.)Wilczek)variety "Ramzan"for the agro climatic conditions of NWFP[J].Pakistan Journal of Botany,2006,38(2):301-310.
[12] 韩粉霞.特早熟优质抗病绿豆新品种豫绿4号[J].中国种业,2002(6):50.
[13] 韩粉霞,李桂英,崔兰芳.高产优质抗病绿豆新品种豫绿2号的选育[J].河南农业科学,1997(9):6.
[14] 赵春霞,郭增志,马建辉,等.绿豆新品种冀绿9239的选育[J].河北农业科学,2005,9(3):96-98.
[15] 王斌,李金国,邱芳,等.绿豆空间诱变育种及其分子生物学分析[J].空间科学学报,1996(增刊1):121-124.
[16] 晋绿豆2号[J].山西农业科学,2002(1):69.
[17] KHAN S,WANI M R,PARVEEN K.Quantitative variability in mungbean induced by chemical mutants[J].Legume Research,2006(29):143-145.
[18] KUMAR S V,TAN S G,QUAH S C,et al.Isolation and characterization of seven tetranucleotide microsatellite loci in mungbean,Vigna radiata[J].Molecular Ecology Notes,2002(2):293-295.
[19] 孙蕾,程须珍,王丽侠.绿豆抗豆象研究进展[J].植物遗传资源学报,2007,8(1):113-118.
[20] LAMBRIDES C J,LAWN R J,GODWIN I D,et al.Two genetic linkage maps of mungbean using RFLP and RAPD markers[J].Australian Journal of Agricultural Research,2000(51):415-425.
[21] 缪建锟,孙黎,彭晓明,等.绿豆防御素基因的克隆、序列分析和植物表达载体的构建[J].石河子大学学报,2006,24(1):112-115.
1 染色体异常
染色体异常或染色体畸变是指染色体的结构或数目发生了异常的变化,包括缺失、重复、易位和倒位4种类型。在21三体(Down综合征)、13三体、15三体、18三体(Eward综合征)、22q11缺失(DiGeorge 综合征)和45X缺失(Turner综合征)等一些染色体异常疾病中,VSD经常发生[4]。由于大约5%~8%的CHDs患儿存在染色体异常疾病,亲代染色体异常在子代VSD发病中具有十分重要的影响。值得注意的是,杜玉荣等[5]的研究结果表明,VSD与22q11 微缺失有关,国外也有类似报道[6]。但22q11微缺失是否与单纯CHDs的发生有关还需要进一步的研究证实。
2 基因改变
同大多数CHDs一样,VSD是一种多基因病,其发病机制仍然没有完全阐明。基因的缺失、重复和突变均可引起基因的改变。随着分子生物学的飞速发展,可能与VSD发病有关的基因逐渐被人们所认识。
2.1 TBX5基因:TBX5 基因属于T-box转录因子基因家族,定位于12q24.1,其cDNA全长2 441bp,有8个外显子,编码1个513个氨基酸的转录因子。TBX5转录因子在心脏、上肢芽和眼中表达。TBX5基因突变会使TBX5转录因子表达异常或表达缺陷,这都将引起心脏发育不良和上肢畸形。对Holt-Oram综合征家系的研究有力阐明了TBX5突变引起房间隔缺损(atrial septal defect,ASD)和VSD的机制[7,8]。
2.2 GATA4基因:GATA4基因属于GATA家族,定位于染色体8p23.1,其cDNA全长1 856 bp,有9个外显子,编码1个438个氨基酸的转录因子,分子质量45 ku。GATA4基因是心脏前体细胞分化的最早期标志之一。有研究发现多种锌指蛋白在VSD患儿中有不同水平地表达,而GATA4作为一种锌指蛋白,在VSD患儿中表达水平下降[9]。
2.3 NKX2.5基因:NKX2.5基因属于NK型同源核基因家族NKX2型的成员之一,定位于5q35,其cDNA全长1 585 bp,有2个外显子,编码1个324个氨基酸的转录因子,分子质量35 Ku。在两个外显子之间有约1.5 Kb的内含子,在其上游约9 Kb处有一含有GATA4的高亲和位点的心脏增强子,对心肌细胞的分化、整个心管的形成与环化起到重要作用。有研究[10]表明NKX2.5突变是ASD发生的一种少见的致病原因,但除此之外,NKX2.5突变与VSD发生有关也得到了普遍认同。
有研究认为TBX5、GATA4和NKX2.5之间存在相互作用,它们的转录激活引发了VSD的形成[11]。H. Chen等[12]也进一步证实了上述几个主要的心脏转录因子、BMP10与细胞周期调节蛋白之间的相互作用是影响孕中期心脏发育转变的重要途径。这也为我们更深入地理解VSD的发病机制提供了依据。Hao Zhang等[10]也发现了一些在VSD发展过程中发挥了重要作用的基因,这些基因涉及了能量代谢、细胞周期和分化、细胞骨架和细胞粘附、LIM蛋白和锌指蛋白等过程和物质,它们的表达水平在VSD患儿中与正常人相比有很大的差异。
3 再显风险率
目前,虽然还没有VSD相关的染色体异常和基因改变的直接的分子遗传学检测,但是可以通过对生育人群的调查来评估它的再显风险率。
4 展望
在最近的几年中,随着分子生物学和医学遗传学的不断发展,不管是单纯的VSD,还是作为某种综合征的一部分,关于VSD致病基因的确认和特性研究都取得了一些有意义的进展。基因突变导致其所编码蛋白的功能异常,影响特异信号转导途径或转录方式,从而产生异常的表型,这一观点越来越受到重视和推崇。一个重要的例子就是Noonan综合征,它与RAS/MAPK信号级联反应异常有关[13]。由于心脏发育从整体上来看比较复杂,从而产生了许多的候选基因,高通量的基因测序技术使我们能够发现更多的致病基因和已知基因的功能,从分子和基因水平阐明VSD或其它CHDs的致病机制。我们可以更加准确地完成对再显风险率的预测,进一步提高早期诊断水平,为基因诊断和治疗提供理论基础。
参考文献:
[1] Hoffman JI.Incidence of congenital heart disease:I. Postnatal inci-dence[J]. Pediatr Cardiol,1995,16:103.
[2] Hoffman JI.Incidence of congenital heart disease:II. Prenatal inci-dence[J].Pediatr Cardiol,1995,16:155.
[3] Correa-Villasenor A,Ferencz C,Loffredo C,et al.Paternal exposures and cardiovascular malformations.The Baltimore-Washington Infant Study Group[J].J Expo Anal Environ Epidemiol, 1993,3:173.
[4] 薛辛东,杜力中.儿科学[M].第一版..北京:人民卫生出版社,2005.307.
[5] 杜玉荣,杨焕杰,谭 震,等. 22q11微缺失与先天性心脏病的关系的研究[J]. 遗传,2005,27(6):873.
[6] Oskarsdottir S,Persson C,Eriksson BO,et al. Presenting phenotype in100 children with the 22q11 deletion syndrome[J]. Eur JPediatr,2005,164(3):146.
[7] Basson CT,Bachinsky DR,Lin RC,et al. Mutations in human TBX5 [corrected] cause limb and cardiac malformation in Holt-Oram syn-drome[J]. Nat Genet,1997,15:30.
[8] Li QY,Newbury-Ecob RA,Terrett JA,et al. Holt-Oram syndrome is caused by mutations in TBX5, a member of the Brachyury (T) gene family[J]. Nat Genet,1997,15:21.
[9] Hao Zhang. Identification of differentially expressed genes in human heartwithventricularseptal defect using suppression subtractive hybridization[J]. Biochemical and Biophysical Research Communi-cations,2006,342:135.
[10] Elliott DA,Kirk EP,Yeoh T,et al. Cardiac homeobox gene NKX2-5 mutations and congenital heart disease: associations with atrial sep-tal defect and hypoplastic left heart syndrome[J]. J Am Coll Cardiol,2003,41:2072.
[11] Garg V,Kathiriya IS,Barnes R,et al. GATA4 mutations cause hu-man congenital heart defects and reveal an interaction with TBX5[J].Nature,2003,424:443.
胃癌是消化系统的常见恶性肿瘤,为全世界范围内发病率最高的癌症之一,根据世界卫生组织癌症研究中心2002年的统计,我国胃癌发病率仅次于日本,位于全球第2位。2007年中国肿瘤登记提示:我国胃癌的发病居第二位,仅次于肺癌,死亡据第三位,仅次于肺癌、肝癌。胃癌在演进过程中随着附加的基因突变会产生不同的亚克隆,使其不断异质化导致其侵袭和转移能力不断加强,而这是胃癌治疗困难和致死的主要原因。国内外学者都在寻求能指导临床方案选择及判断预后的胃癌分型,传统的癌症诊断对病理学依赖性较大,有时会因为肿瘤的不典型或临床信息的不完整而造成诊断困难。应用基因分析技术所产生的信息,特别是应用高通量芯片技术所产生的信息可以为胃癌分型提供更多的参考,因此对目前胃癌相关的分型予以综述。
1 胃癌的传统分型
胃癌病理分型是以组织形态结构和细胞生物学特性为基础,不同类型的胃癌,其形态结构和生物学行为各异,流行病学和分子机制亦不同,以致现有的胃癌分型系统众多。目前,常用的是WHO型、Lauren分型,大体分型主要使用Borrmann分型。
1.1 WHO胃癌包括以下常见组织学类型
状腺癌、管状腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌、腺鳞癌、鳞癌、小细胞癌、未分化癌。此外,胃内还可以发生类癌。WHO分型将Lauren分型的肠型、弥漫型纳入腺癌之下。其管状腺癌还可进一步分成高分化、中分化与低分化腺癌。少见类型或特殊类型胃癌有:实体型变异、肉瘤样变异等。
1.2 1923年德国病理学家Borrmann提出的一种胃癌大体形态分型方法,此分型主要根据癌瘤在黏膜面的形态特征和在胃壁内的浸润方式进行分类,将胃癌分为4型:Ⅰ型(结节型),II型(溃疡局限型),III型(浸润溃疡型),是最常见的类型,约占50%。Ⅳ型(弥漫浸润型),由于癌细胞弥漫浸润及纤维组织增生,胃壁呈广泛增厚变硬,称“革囊胃”。Borrmann分型是胃癌经典的分型方法,既能反映胃癌的生物学行为,又简洁实用,国际上广泛采用。
1.3 Lauren分型将胃癌分成两大主要类型,即肠型与弥漫型,当肿瘤内两种类型成分相当时就称为混合型。胃癌发生是一个多步骤的过程,弥漫型和肠型在肿瘤发生各个阶段会产生多种基因及表观遗传学方面的变异。常见的包括抑癌基因的点突变和杂合性丢失,常见的表观遗传学异常包括CPG岛的甲基化引起的肿瘤抑制基因沉默和肿瘤促进基因转录水平的增高。
2 胃癌分型与分子病理学
胃癌分型研究的意义在于探索其是否对判断预后有价值或者对于今后的治疗有指导意义。当前,国内张树华采用组织病理与组织化学和免疫组织化学技术相结合的方法,兼顾宿主的免疫防御反应,把胃癌分为两型:限制生长型和促进生长型。限制生长型预后较促进生长型好。
根据黏蛋白标记的差异,胃癌组织被分为4型:1)胃型:胃型黏蛋白标记的胃癌细胞>10%;2)胃肠型:胃型黏蛋白标记的胃癌细胞> 10%且肠型黏蛋白标记的胃癌细胞>10%;3)肠型:肠型黏蛋白标记的胃癌细胞>10%;4)未分类:胃肠黏蛋白标记的细胃癌细胞
Solcia等对对294例平均随访时间长达150个月的胃癌进行研究显示,如果将胃癌的组织学结构、细胞异型性程度、p53基因突变、18q杂合性缺失、微卫星不稳定性以及有无脉管神经浸润等因素与预后综合分析,可以将胃癌恶性程度分成三级。胃癌I级(预后良好型)包括:大量肿瘤内/旁淋巴样细胞反应型、高分化管状腺癌、黏液结节型和促纤维结缔组织增生性弥漫型胃癌,I级胃癌约占全部胃癌病例的37%。胃癌III级(预后不良型)包括:高度异型性胃癌、浸润型黏液腺癌、肿瘤细胞异型性中等但具有p53基因的第7或第8外显子突变、伴有血管淋巴管浸润以及神经浸润者,III级胃癌占全部胃癌病例的19%。其他胃癌则归属于预后中等的胃癌Ⅱ级,占全部胃癌的44%。这一关于胃癌恶性程度评价体系虽然是不依赖于临床分期的胃癌预后判断新标准,但实际操作中涉及到微卫星不稳定性的分子遗传学检测、p53基因突变检测以及EB病毒原位杂交检测等实验技术,在临床普及以及操作流程标准化控制等方面均有待统一。
3 微卫星不稳定性与胃癌分型
微卫星不稳定性[MSI]是胃癌发生过程中的一个常见事件,反应了肿瘤潜在DNA错配修复缺陷,常常由Hmlh1启动子区甲基化引起,胃癌合并MSI者其临床病理因素特别,预后相对良好,胃肠道肿瘤中MSI的测定是最先被广泛利用的预后分子检测之一。MSI的检测常采用荧光定量多重PCR进行,费用相对低,适用性广。以往的很多观察表明,胃癌中MSI的存在不仅仅是与已知的与组织病理特征强关联的分子分型标志,同时MSI能能区分预后良好好亚组。因此Simpson等建议将MSI作为一个有效的分子分型工具。葡萄牙的一项研究表明,胃癌患者并低度MSI五年生产率为30%相比,而高度MSI者则为70%。韩国的一项大型研究也表明在胃癌分期为II、III期的患者MSI与预后良好有关。
4 胃癌的分子分型
以分子特征为基础的新型分类体系即分子分型。高通量的基因分析可以是DNA水平的基因多态性分析、DNA甲基化分析和基因拷贝数分析.也可以是RNA水平的基因表达谱分析、微小RNA表达谱分析和蛋白表达水平的蛋白芯片分析等。
肿瘤分子分型的基础:目前可以在DNA、RNA和蛋白质水平上进行肿瘤分子分型的研究。在DNA水平,可以依据基因突变、基因组的细胞遗传学改变或甲基化差异进行分型。根据基因表达谱(RNA水平)的差异实施分型,是目前分子分型的研究主体,以表达谱芯片为基础的分子分型研究数据处理分二类:一是,unsupervised analysis;二是,supervised analysis。在蛋白质水平,可以根据蛋白质表达谱的差异,亚细胞结构蛋白组成的不同或蛋白质翻译后修饰的改变来进行分型。
1基因诊断
基因诊断(gene diagnosis)又称DNA诊断或分子诊断,通过从体内提取样本用基因检测方法直接检测基因结构及其表达水平的改变,检测病原体基因型,进而判断是否有基因异常或携带病原微生物,或利用分子生物学技术从DNA水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷。应用基因诊断技术可以针对已确诊或拟诊遗传性疾病的患者及其家系成员,根据遗传学的基本原理,通过分子生物学的实验手段检查被检个体相关基因的异常,确定隐形携带者状态及在症状出现前的疾病易感性等,从而达到临床确诊的目的。因此,基因诊断迅速在临床诊断领域特别在遗传病研究领域得到了较为广泛的应用。目前的基因诊断方法主要有核酸分子杂交、聚合酶链反应及相关技术、DNA序列测定、DNA芯片、连锁分析等。
2单基因遗传病
单基因遗传病是指由单个基因异常导致且以孟德尔方式遗传的疾病,是我国常见出生缺陷的重要原因之一,较为常见且研究较多的有血友病、苯丙酮尿症(PKU)、肝豆状核变性、地中海贫血等等。除部分单基因遗传病可通过手术加以矫正外,绝大部分遗传病是致死、致残、致畸性疾病,且目前均无法治疗,进行遗传性疾病的产前诊断,是避免致死、致残、致畸性疾病胎儿出生的重要手段。
3基因诊断的应用
3.1在B型血友病中的应用
血友病B(hemophilia B)是因凝血因子Ⅸ(FlX)基因缺陷引起的x-连锁隐性遗传出血性疾病,在男性中的发病率约为1/30000,散发率可达患者总数的30%-50%[1]由于目前还不能根治,对于携带者和高危胎儿进行基因诊断非常必要。血友病B基因缺陷类型十分繁多,基因缺陷包括缺失、插入和点突变,其中80%左右为单个碱基突变[2]。目前已发现的突变位点中,除了导致氨基酸序列改变的突变外,还发现不少的CpG区、剪切位点的突变[3]。常用于血友病B连锁分析的方法有限制性片段多态性(restriction fragment length polymorphisms,RFLP)和短串联重复序列分析,但在中国人群中具有多态性的酶切位点很少。王学锋等[4]利用这6个短串联重复序列(STR)位点对8个血友病B家系进行连锁分析,诊断率达到99.99%。王莉等[5]在研究家系1和家系2中,发现分别有2个和3个位点可以提供信息,结果支持2例胎儿均未获得风险染色体,这与突变分析结果一致。连锁分析适于有家族史的血友病B或无家族史但携带者明确的产前诊断,且实验操作和结果分析相对简单,适用临床开展应用,是一种快速和有效的基因诊断方法
3.2在地中海贫血中的应用
地中海贫血是一组常染色体隐性遗传病。它是由于珠蛋白基因突变,使珠蛋白生物合成受阻、产量不足或缺如所致。地中海贫血常见有两种类型:α-地中海贫血和β-地中海贫血。β -地中海贫血是由于β珠蛋白基因突变导致β珠蛋白链合成障碍的慢性溶血性贫血。β珠蛋白基因位于11号染色体短臂(1lpl5)。绝大多数β-地中海贫血是由于基因发生点突变所致,少数为基因缺失所致。突变基因特异型扩增系统(amplification refractory mutation system)法能快速鉴别诊断β-地中海贫血,简便可靠,可用于中国人非缺失型地中海贫血的基因诊断和产前诊断,便于基层单位应用。α-地中海贫血是由于α-珠蛋白基因缺失或缺陷使α-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血在我国则以南方地区多见,如广西、广东、四川、云南等地。由于大部分α-地中海贫血是由于α-基因缺失所致,因此可运用基因诊断法对α-基因进行检查,针对α-地中海贫血的诊断具有重大的现实意义。基因诊断的探测目的物至少包括DNA和mRNA。Mullis建立PCR技术,多年来,这种技术在实际运用中发挥了重要的作用,为遗传病的诊断提供了更加可靠的依据。PCR是利用DNA聚合酶等在体外条件下,催化一对引物间的特异DN段合成的基因体外扩增技术。Southern杂交是研究DNA图谱的基本技术,在分析PCR产物和遗传疾病诊断分析等方面有重要价值,它被认为是分析α珠蛋白基因缺陷的金标准。根据每个突变位点的特异扩增带来判断结果,在诊断各种缺失型α-地中海贫血时便于临床推广[6]。
文婕等[7]引进简便、快速的多重PCR技术、PCR-RFLP方法和PCR-RDB法,可准确地进行地中海贫血基因诊断。用于地贫高危胎儿的产前诊断中,对预防重型患儿出生有较好的临床价值。从112例疑似地贫的患者中检出α-珠蛋白基因突变和β-珠蛋白基因突变患者共59例,研究表明,α-地贫95%以上为缺失型,其分子基础主要是α-珠蛋白基因大片段缺失。限制性片段长度多态性(RFLP) 连锁分析法[8]是用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并电泳分离,从而检测地贫基因。基因芯片诊断技术在核酸扩增的基础上,采用荧光标记及引物延伸的方法,可提高检测结果的敏感性和特异性,由于基因芯片高通量特点,可将α、β地中海贫血基因诊断在一张芯片上完成,适用于大面积普查[9]。
3.3在苯丙酮尿症中的应用
苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是儿科常见的氨基酸代谢病,因苯丙氨酸羟化酶基因突变导致PAH活性降低或丧失,过量苯丙氨酸和旁路代谢产物的神经毒性作用造成患儿严重智能障碍和继发性癫痫。国内外普遍开展的新生儿疾病筛查是诊断PKU的有效方法,而基因诊断较之生化筛查方法的优势在于能从DNA 水平了解病因,诊断特异性高,在个体发育的任何阶段,任何有核细胞都可以进行诊断,同时也为产前诊断和潜在新治疗方法的研究提供依据。Sudha Kohli等[10]采用该多态标记对一例PKU家系进行分析,结果先证者遗传了来自母亲的致病的等位基因1,而胎儿则遗传了来自母亲的正常的等位基因2,从而对胎儿作出了确诊。宋等[11]利用测序技术检测了北方地区230例PKU患儿PAH 基因全部外显子,发现75种不同的突变(94.6%),其中3种为新发现位点。基因诊断结果可能预知PKU的病情轻重程度,指导临床分类和治疗[12]。
3.4在肝豆状核变性中的应用
肝豆状核变性又称Wilson病(Wilson's disease,WD),是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病。WD为目前少数可以治疗的神经遗传病之一,患者如果能在发病早期或症状前期即被确诊并得到及时治疗,大多预后良好,反之,病情逐渐加重甚至危及生命[13]。虽然典型的WD患者根据特征性临床表现及实验室铜代谢检查等不难诊断,但许多患者早期症状复杂多样,极易被误诊为其他疾病[14],铜代谢检查又存在假阴性或假阳性结果[15],因此,本病的早期诊断特别是症状前期和产前诊断较为困难。近年来,伴随基因组计划出现和发展起来的DNA微阵列技术以其固有的小型化、并行性和高通量等特点,在生物分子信息获取,特别是生物基因组的再测序、基因多态性的信息检测和基因表达监测等方面得到了快速的发展和应用。DNA微阵列技术与WD基因高度遗传异质性的特点相契合,是一种极具潜力的WD基因检测工具。2003年,Baner等[16]采用等位基因特异性封闭探针(allele-specific padlock probes)结合DNA微阵列技术对75例欧美裔WD患者13个基因突变及多态位点进行检测,经DNA测,序结果证实其准确率达100%。首次证实了该技术用于WD基因诊断的可行性。Harmut等开发了一种可以检测60种WD基因突变的DNA微阵列芯片,但仍不能包含一些少见的和新发现的突变[17]。因此,该技术目前尚处于研究探索阶段,加之建立DNA微阵列技术平台投入不菲,其面向临床应用尚需待以时日。
4结语
随着“人类基因组计划”的完成和“后基因组计划”的实施(即是对基因功能的研究和基因与人体疾病关系的研究),分子生物学技术将会越来越普及、方便地运用到基因诊断领域。现代生物科学和其他学科技术的不断发展和完善,在不久的将来,即可把所有的基因都固定于1块芯片上时,就成了一块多基因疾病检测的万能芯片,它可适用于任何多基因疾病的检测,为临床检测工作带来极大的便利。总之,分子生物学和分子遗传学的飞速发展必将极大的促进基因诊断技术的进步。有理由相信,以基因诊断为基础的基因治疗必将成为人类治疗自身疾病的主流技术,并极大地促进人类卫生事业的进步。
参考文献
[1] Mukherjee S,Mukhopadhyay A,Chaudhuri K.el a1.Analysis of haemophilia B database and strategies for identification of common point mutations in the factor IX gene.Haemophilia,2003,9:187-192.
[2] Carmen E,Pilar C,Satumino H,et al,Molecular anMyms in hemophilia B families:identification of six new mutations in factor IX gene.Haematologiea,2003,88:235-236.
[3] Tagariello G,Belvini D,Salviato R,el a1.The Italian haemophilia B mutation database:n tool for genetic counselling,carrier deteetion and prenatal diagnosis Rosanna Di Gaelano.Blood Transfus,2007,5:158-163.
[4] 王学锋,刘元肪,刘湘帆,等.血友病的携带者与产前分子诊断.中华检验医学杂志,2003,26:540-542.
[5] 王莉,廖世秀,王应太等,应用两种方法对血友病B家系进行产前基因诊断[J]. 中华血液学杂志2010,31(3):192-195.
[6] Baig SM.Molecular diagnosis of beta-thalassemia by mul-tiplex ARMS-PCR:a cost effective method for developing count ries 1ike Pakistan[J].Prenat Diagn,2007,27(6):580.
[7] 文婕,朱宝生,刘培玲等,9例地中海贫血患者的基因诊断研究[J],中国产前诊断杂志.2009,11:9-14
[8] Zeren F.Preliminary Data on Preimplantation Genetic Diagnosis for Hemoglobinopathies in Turkey[J].Hemoglobin. 2007,31(2):273.
[9] Bang-Ce Y,Hongqiong L.Zhuanfong Z,et a1.Simultaneous detection of alpha-thalassemia and beta-thalassemiaby oligonucleotide microarray [J].Haematologica,2004,89(8):101.
[10] Kohli S,Saxena R,Thomas E,et al.Prenatal diagnosis of phenylketonuria[J]. Indian J Med,2005,122:400-403
[11] 宋,瞿宇晋,杨艳玲,等.中国北方地区苯丙氨酸羟化酶基因的突变构成[J].中华医学遗传学杂志,2007,24:241-246.
[12] 瞿宇晋,宋.苯酮尿症的分子研究及其基因型-表型相关性的研究进展[J].国际儿科学杂志,2006,1:23-26.
[13] Ala A,Walker AP,Ashkan K,et a1.Wilson's disease.Lancet,2007,369:397-408.
[14 ]胡纪源,吕达平,王共强,等.肝豆状核变性的临床误诊研究.中华医学杂志,2001,81(11):642-644.
近年来,随着分子生物学技术的发展,靶向化疗药物的不断出现,联合化疗以及造血干细胞移植的不断改进,儿童急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)的疗效显著提高,其长期生存率可达90%[1]。尽管如此,仍有15%~20%儿童ALL出现复发,并成为ALL患儿获得长期生存的主要障碍和死亡的重要原因。因此,进一步寻找与复发ALL预后相关的分子遗传学异常是未来的研究方向。2009年,DenBoer等[2]和Mullighan等[3]首次发现约有15%~19%遗传学分型不明的B-ALL患儿基因表达谱与BCR-ABL1阳性ALL患儿相似,预后也与其相似,将其称为Ph-likeALL,其基因组学改变的共同特征为存在细胞因子受体基因突变和激酶信号通路异常活化,针对这些信号通路的激酶抑制剂已经使部分患者获得了更好疗效[4]。本文就近年来儿童Ph-likeALL的研究进展作一综述。
1Ph-likeALL的基因改变与发病机制
1.1JAK激酶通路基因异常
1.1.1CRLF2基因重排与过表达
CRLF2(cytokinereceptor-likefactor2)基因位于性染色体Xp22.3或Yp11.3,编码细胞因子受体样因子-2,也称胸腺基质淋巴细胞生成素受体(thymicstromallymphopoietinreceptor,TSLPR)。TSLPR是一种I型细胞因子受体,与配体TSLP结合后可与白介素7受体(IL-7R)的α链形成异源二聚物,启动下游的JAK-STAT信号通路,参与淋巴细胞增殖的调控[2,5]。42%的儿童Ph-likeALL存在CRLF2基因异常,以易位最常见,主要形成IGH-CRLF2和P2RY8-CRLF2两种重排基因,导致CRLF2过表达[6]。部分Ph-likeALL存在其他未知因素导致CRLF2过表达[7]。而CRLF2过表达将持续活化下游JAK-STAT信号通路,导致白血病细胞持续增殖。此外,CRLF2的F232C点突变(第232位氨基酸由半胱氨酸代替苯丙氨酸)可促使非配体依赖性的同源二聚体形成而异常活化下游信号通路参与白血病发生[8]。值得注意的是,CRLF2-IL7R-JAK-STAT通路激活并非仅存在于Ph-likeALL,约60%唐氏综合征ALL患儿也存在此通路异常活化[9]。
1.1.2JAK基因突变与重排
CRLF2过表达的Ph-likeALL中,约50%伴有JAK基因突变,以JAK2R683突变最多见[8,10]。JAK基因突变一方面导致CRLF2或IL-7R发生激活突变,另一方面使编码抑制JAK的接头蛋白LNK的SH2B3基因发生失活性突变,从而活化JAK-STAT信号通路,这亦提示CRLF2的过表达和JAK基因突变在活化JAK-STAT信号通路中有协同作用[4]。在儿童Ph-likeALL中,JAK基因家族除发生突变,约5%存在JAK2基因重排。目前文献报道共计10种基因与JAK2形成融合基因,包括PAX5-JAK2、BCR-JAK2、ETV6-JAK2、SSBP2-JAK2、ATF7IP-JAK2、EBF1-JAK2、PPFIBP1-JAK2、STRN3-JAK2、TERF2-JAK2和TPR-JAK2,其产生的融合蛋白保留JAK2的激酶区域并持续激活,导致JAK-STAT信号通路持续活化[11]。
1.1.3红细胞生成素受体基因重排
红细胞生成素受体(erythropoietinreceptor,EPOR)基因重排见于4%的儿童Ph-likeALL,主要形成EPOR-IGH、EPOR-IGK和EPOR-LAIR1融合基因,即EPOR基因易位到免疫球蛋白重链(IgH)或轻链(IgK)的增强子区和LAIR1的上游区域,这一改变导致截短型EPOR过度表达,对EPO呈高敏感,激活JAK-STAT信号通路,早期参与白血病的形成[12]。
1.2ABL激酶通路基因异常
不同于JAK通路基因的异常,ABL基因异常只涉及重排。约14%的儿童Ph-likeALL存在ABL家族基因重排,包括ABL1、ABL2、PDGFRB及CSF1R基因,这些基因虽然存在众多且不确定的伙伴基因(见表1),但其转录产物的结构与功能均与BCR-ABL融合蛋白类似,可使酪氨酸激酶异常活化,导致细胞持续增殖。PDGFRB(platelet-derivedgrowthfactorreceptorβ)基因编码血小板衍生生长因子受体β,其为Ⅲ型受体酪氨酸激酶家族的一员[14]。PDGFRB重排最早在骨髓增殖性肿瘤中发现,但目前发现ALL中也有PDGFRB特征性重排,以EBF1(earlyB-cellfactor1)-PDGFRB融合基因最常见。EBF1是B系淋巴细胞分化必需的转录因子,EBF1的编码区与PDGFRB的羧基端融合,一方面影响EBF1的正常功能,使细胞分化停滞于淋系B前体细胞阶段,另一方面致PDGFRB过表达,导致细胞持续增殖[13]。集落刺激因子1受体(colonystimulatingfactor1receptor,CSF1R)基因是巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolonystimulatingfactor,M-CSF)受体的编码基因,其激活见于粒单核细胞白血病,而在Ph-likeALL中CSF1R可与单链DNA结合蛋白基因SSBP2形成SSBP2-CSF1R融合基因,持续的细胞因子受体信号可使SSBP2被ABL1磷酸化而参与肿瘤形成[15]。
1.3淋系转录因子基因异常
淋系转录因子基因主要包括EBF1、PAX5和IKZF1[11]。IKZF1编码的锌指转录因子IKAROS是淋巴细胞发育、分化过程中的一种重要转录因子。50%~70%的Ph+和PhlikeB-ALL存在IKZF1的遗传学改变[16],主要为IKZF1的单等位基因丢失、内部外显子缺失和移码、错义突变,导致IKROS剂量不足或产生突变型IKROS,从而使B细胞发育停滞,同时增强激酶依赖的细胞增殖和更新[17]。此外,突变型IKROS自身蛋白功能受损的同时还可以显性失活的方式影响正常IKAROS。Witkowski等[18]研究发现IKZF1基因突变可激活B-ALL中大量与细胞增殖和耐药相关的基因,但具体机制仍不明确。PAX5和EBF1基因也是B细胞发育早期所需的转录因子,其与激酶基因易位形成融合基因如PAX5-JAK2、EBF1-JAK2、EBF1-PDGFRB,不仅阻滞细胞分化,同时亦促进细胞增殖[19]。
1.4其他基因异常
在Ph-likeALL中,SH2B3基因的失活性突变导致衔接蛋白LNK量减少,刺激IL7激活JAK-STAT信号通路,导致细胞持续增殖[20]。IL-7R、FLT3和IL2RB基因的突变也可激活细胞因子受体参与Ph-likeALL的形成。Ras信号通路突变包括NRAS、KRAS、PTPN11和NF1突变,发生在4%的儿童Ph-likeALL[5]。GATA3蛋白是一种具有结合GATA序列高度保守锌指结构的转录因子。全基因组关联分析研究(genome-wideassociationstudy,GWAS)发现儿童Ph-likeALL中GATA3rs3824662单核苷酸多态性(SNP)明显不平衡,其中A等位基因表达率更高[21]。rs3824662A等位基因不仅致GATA3mRNA表达更高,且多伴随CRLF2异常、JAK突变及IKZF1缺失,但导致Ph-likeALL发生的具体机制目前仍不明确。
2Ph-likeALL的临床特征
不同年龄阶段Ph-likeALL的发生率不同,在儿童、青少年、年轻成人、成年人及老年人ALL的发生率分别为10%~15%,21%,27%、20.4%和24%[5,22]。在儿童Ph-likeALL人群中,大年龄组患儿所占比例更高,男:女之比为1.5:1,而且西班牙裔发病率更高[2,5,21]。儿童Ph-likeALL初诊时外周血白细胞总数偏高,多超过100×109/L[5];早期治疗反应不佳,诱导化疗第19天及诱导结束时MRD水平均较非Ph-likeALL组更高[23]。有研究发现,存在EBF1-PDGFRB重排的ALL患儿更易发生诱导化疗失败[24]。多项研究证实,儿童Ph-likeALL具有高复发率和不良预后的特点[5,25]。Roberts等[5]以1725名ALL患者为研究对象,发现各年龄段的Ph-likeALL患儿5年无事件生存(event-freesurvival,EFS)率显著低于非Ph-likeALL组。美国儿童肿瘤协作组(Children'sOncologyGroup,COG)对772例高危组儿童ALL进行随访,Ph-likeALL组5年EFS明显低于非Ph-likeALL组[10]。此外,各种基因改变类型的Ph-likeALL的预后也不同,以发生JAK2和EPOR重排的生存率更低,伴随IKZF1异常的Ph-likeALL预后更差[5]。美国St.Jude儿童医院随访344例儿童ALL,依据诱导化疗第19天和46天MRD水平调整危险度,高危组患儿优先接受造血干细胞移植治疗,虽然结果显示Ph-likeALL组与非Ph-likeALL组的EFS差异无统计学意义,但是Ph-likeALL患儿进入高危组以及接受造血干细胞移植患儿的比例较高[23]。
3Ph-likeALL的诊断儿童
Ph-likeALL的分子生物学改变呈现高度异质性使其诊断充满挑战,目前尚无统一的诊断标准。美国St.Jude儿童医院对所有新诊断的ALL采用二代测序方法筛选Ph-likeALL,英国研究中心对于早期化疗效果差的ALL进行ABL相关重排基因检测,COG利用良好验证性的基因芯片对所有新诊断的高危组ALL进行初步筛选,阳性者在诱导化疗中进行基因检测验证。最早Ph-likeALL的诊断是通过分析基因表达谱与Ph+ALL的相似性来确定,但这较大程度依赖基因芯片的选择,而选择不同基因组分析表达谱的结果将会不一致,使其临床应用受到限制。高通量新一代测序虽可检测出完整的基因突变,展示基因表达谱,但其昂贵的费用及高度依赖生物信息技术使其不能广泛推广。而核型分析、FISH、多重PCR等技术只能检测到部分异常基因。Yap等[25]针对一些常见的靶向融合转录子测序有效检测到Ph-likeALL众多异常基因。在Ph-likeALL的诊断中明确异常活化的激酶信号通路有助于靶向药物的选择。采用流式细胞术分析JAK2下游的STAT5和ABL下游的CRKL磷酸化水平不仅可明确异常激活信号通路,还能绕过特定遗传学病变的诊断困境,同时分析酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors,TKIs)治疗前后的相关下游分子磷酸化水平可预测TKIs治疗反应能力。此外,儿童Ph-likeALL最常见的分子遗传学改变为CRLF2的异常表达。正常情况下CRLF2蛋白不会在B细胞中表达,因此可将CRLF2抗体加入到ALL免疫表型的分析中,并且通过FISH、多重PCR、多重交联探针扩增以及基因组芯片等验证其基因改变类型。
4Ph-likeALL的治疗
Ph-likeALL中约90%存在激酶异常激活,主要为ABL和JAK激酶通路基因异常,因此TKIs治疗Ph-likeALL有较好的前景[5,26-28]。ABL抑制剂伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)适用于发生ABL1、ABL2、PDGFRB或CSF1R重排者,JAK抑制剂鲁索利替尼(ruxolitinib)可有效抑制JAK-STAT信号通路的异常激活,存在ETV6-NTRK3融合基因者对ALK抑制剂克里唑替尼(Crizotinib)敏感[5,13,29]。Weston等[28]报道1例伴EBF1-PDGRFB易位的10岁男性ALL患儿在常规化疗效果不佳后加用伊马替尼,骨髓迅速缓解并持续完全缓解超过1年。Kobayashi等[30]报道1例达沙替尼单药成功治疗儿童Ph-likeALL。Roberts等[5]对12例接受TKIs治疗的Ph-likeALL随访,11例获良好疗效。但TKIs治疗Ph-likeALL的有效性及安全性还需进一步研究。COG正在进行两项临床试验以检验BFM方案巩固治疗阶段加入达沙替尼治疗ABL重排Ph-likeALL的疗效,并评估鲁索利替尼联合化疗治疗JAK-STAT通路异常激活的Ph-likeALL的疗效,以寻找鲁索利替尼最佳剂量。2015年中国儿童癌症协作组(ChineseChildrenCancerGroup,CCCG)启动ALL2015研究方案(CCCG-ALL-2015),亦将TKIs治疗Ph-likeALL纳入临床试验中。Ph-likeALL中CRLF2重排除涉及JAK-STAT外,还有PI3K、mTOR和BCL2信号通路的异常激活,针对这些信号通路的抑制剂正在进行相关的临床前和临床研究[29,31-32]。也有针对Ras信号通路抑制剂治疗Ph-likeALL的早期临床试验[33]。Tasian等[34]对Ph-likeALL小鼠模型进行研究,发现PI3K/mTOR(phosphoinosmde-3-kinase/themammaliantargetofrapamycin)抑制剂gedatolisib联合鲁索利替尼或达沙替尼的治疗效果优于单药治疗,能更大程度抑制白血病细胞增殖。虽然TKIs治疗Ph-likeALL显示良好的研究前景,但接受TKIs治疗后仍可能复发或死亡[35]。在细胞株和小鼠模型中发现,对于JAK抑制剂治疗效果差者使用热休克蛋白90(heat-shockprotein90,HSP90)抑制剂可成功抑制白血病细胞增殖及下游信号通路活化[36-37]。在IKZF1突变致白血病的小鼠模型中,维A酸可改善TKIs的耐药并同时增强TKIs的活性[38]。然而,HSP90抑制剂及维A酸能否用于临床需进一步研究。
1 常用白血病MRD检测方法的研究进展
1.1 分子生物学方法:遗传学的改变,包括染色体易位/缺失、基因突变等是白血病发生的基础,其所导致的正常基因表达调控紊乱和功能异常是白血病发生的主要原因。异常的遗传学改变,已成为急性白血病临床检验资料的重要组成部分。
实时定量聚合酶链反应( RQ-PCR ) 方法结合了PCR和荧光探针两种技术,通过定量检测白血病细胞中标志性基因实时观测MRD,是目前检测MRD最为敏感的方法,灵敏度可达10-4-10-5,已成为临床实验室建立MRD检测方法的首选。其检测的基因标志包括:(1)染色体异位形成的融合基因。如t(9:22), t(15;17),inv(16), and t(8;21),T 细胞受体(T-cell receptor ,TCR)重排等,常见的融合基因包括: TEL /AML1、BCR /ABL、E2A /PBX1、MLL /AF4等。(2)在白血病中表达增高的肿瘤基因(如PRAME、 WTI 、PRAME、NPM1、STC- 1 等基因。(3)发生突变的基因(如FLT3 /ITD)。融合基因直接反映了白血病的病理特征,他在疾病发展过程中比较稳定,以其作为PCR检测MRD的分子标志具有特异性强、敏感度高的优点[2]。但是这些检查不仅价格昂贵,其检测的标本为RNA,存在不易保存,结果不稳定的缺点。更令人遗憾的是,由于白血病是一组异质性很大的恶性血液病,各亚型之间遗传背景不同,这些遗传学基因标志只能覆盖1/3的白血病类型,还有2/3类型的白血病不具备遗传学基因标志,无法在临床上进行MRD的检测。即使联合应用多种基因仍有40%~50%的患者无法找到适当的基因标志检测MRD,使其疾病状态缺乏准确的判断依据。
1.2流式细胞术( FCM):FCM是通过检测在正常细胞上不表达或低表达而在白血病细胞上表达或高表达的白血病相关免疫表型来定量检测MRD,能够准确定量残留白血病细胞数,并且还能了解残留白血病细胞的凋亡情况[3]。其优势是每秒可检测5 000~10 000个细胞,并能用计算机记录处理,快速地对各个细胞进行多参数定量分析,灵敏度达到10- 4。但应用此法必须要对患者初发时的免疫表型特征有详尽了解,以便选择适当的标志检测MRD。因为白血病细胞与正常细胞相比, 通常低达10- 5~10- 6, 可能低于FCM检测范围而使这种方法缺乏特异性; 而且随着病程发展, 细胞表面的抗原发生改变, 会导致假阴性结果。
2 异常DNA甲基化检测白血病MRD的临床研究进展
DNA甲基化是指在DNA序列不变的情况下,通过影响基因转录活性以调控基因的表达。DNA甲基化作为一种表观遗传学改变与白血病的发生密切相关,在不改变遗传信息的前提下导致细胞遗传特性改变,作为肿瘤性疾病"二次打击"经典假说的重要补充,已成为白血病研究的新热点。DNA异常高甲基化导致抑癌基因的失活在白血病发生发展、诊断、监测微小残留病、预测病情以及指导治疗方面都有重要作用,这些表观遗传学标志作为MRD监测标志物的临床研究逐渐引起大家的关注。
P15基因甲基化与白血病的关系目前研究最为深入。73%~93%的急性髓系白血病(AML)和57%的急性淋巴细胞白血病(ALL)患者发生p15基因高甲基化,且持续p15基因高甲基化预示疾病复发。与p15基因甲基化患者相比,p15基因非甲基化患者5年DFS明显延长(15% v 62.5%;p=0.02)[4]。
Au等[5]检测了l7例t-MDS/AMI 患者,l5例存在pl5甲基化。其中5例在发展为治疗相关的t-MDS/AML前即已存在pl5甲基化,最早为两年前。提示pl5甲基化发生在t-MDS/AMI 早期,检测p15甲基化有助于判断预后、指导治疗。在一组65例急性早幼粒细胞白血病的研究中,31例存在p15甲基化的患者5年无病生存率仅为29.64% ,显著低于34例无甲基化的患者79%。p15基因甲基化与预后不良相关。
Id4和zo-1是我室新发现的两个血液系统相关候选基因,并对其在白血病发生、复发中的作用及应用于MRD检测进行了系列基础与临床研究。
采用MS-PCR的方法对完全缓解期白血病患者骨髓标本检测id4基因甲基化状态,结果发现:(1)58例完全缓解的急性白血病人MRD的检出率为41%,MRD阳性的患者12个月内复发率为62.5%,而非甲基化的患者12个月内复发率仅为10%。(2)16例异基因外周血干细胞移植后的白血病患者中,5例检测到MRD的患者中有4例在1年的随访期出现复发,而11例移植后MRD持续阴性的患者无一例复发。
研究对26例完全缓解的急性白血病患者进行zo-1基因甲基化检测,MRD检出率为34.6%,MRD阳性的患者12个月内复发率为57.1%,而非甲基化的患者12个月内复发率仅为15.4%,MRD阳性病人复发率明显高于阴性者。Id4和zo-1基因甲基化检测可能成为急性白血病新的生物标记用于预测疾病的预后以及复发。
随着PCR 技术的进步,将实时定量PCR(real-time PCR)与MSP 结合提高了甲基化分析检测的特异性和敏感性。高敏感性的甲基化定量PCR为MRD检测开辟了另一种解决方法。甲基化定量水平的变化对于细胞修复、肿瘤预后、肿瘤化疗后的耐药等提供了新的研究指标,可以从另一个层面上揭示其发生机制。因此,甲基化定量PCR技术被应用与临床各领域的研究。
Shuchi等[6]以启动子区高甲基化状态的雌激素受体α(estrogen receptor α;ER-α)和 p15INT4B 基因做为MRD标志,采用定量甲基化特异性PCR对180例急性白血病患者骨髓标本进行检测,结果发现:(1)临床缓解期的AML患者中, ER-α和p15INT4B基因启动子区呈现高甲基化状态的患者较低甲基化状态的患者有更高的复发风险,而且ER-α和p15INT4B基因启动子区甲基化水平的增高与患者无病生存期(disease free survival,DFS)缩短有明显相关性。(2)对5名儿童ALL患者ER-α基因启动子区甲基化程度进行了自诱导缓解后的追踪检测,结果提示疾病复发状态较缓解状态ER-α基因启动子甲基化水平增加。其结果与目前常用的MRD监测标志TCR/免疫球蛋白重排水平结果基本一致。
另一研究以启动子区高甲基化状态的p73、p15、p57KIP2基因为MRD标志,通过对199例Ph染色体和MLL阴性的处于完全缓解状态(complete remission,CR)的成人ALL标本进行定量甲基化特异性PCR检测,研究结果提示p73基因启动子区甲基化水平与第一次CR持续时间及无病生存期(DFS)及总生存期(overall survival, OS)缩短间有显著相关性[7]。因此,特定基因的定量甲基化PCR检测有可能成为一种评估急性白血病复发风险及MRD检测的有效手段。
结语
白血病作为一种恶性肿瘤,复发是影响其患者生存的主要问题。患者体内白血病微量残留病是复发的主要根源,对患者进行微量残留病监测在白血病的治疗和预后判断中具有非常重要的意义。遗憾的是,由于绝大多数患者缺乏明确的遗传标记作为早期检测和准确评估MRD的标志,在临床上常因治疗不足导致疾病复发或治疗过度引起严重并发症,绝大多数患者在发病后1~3年内死亡。因此,要在白血病MRD早期检测和指导治疗上有所突破,就必须寻找能够早期诊断白血病MRD的特异性强、通用性好的分子标志物。DNA 甲基化作为肿瘤相关标记,与遗传学标记、细胞表面抗体等标志具有更多的优势。首先,临床常规的肿瘤标记检测以蛋白或者RNA为对象,必须采集新鲜样本以确定检测结果的准确性。而甲基化检测则以DNA 为样本,很容易从各种体液中,甚至石蜡包埋组织中得到,极大地扩展了研究资源。其次,甲基化以DNA作为研究对象,较RNA 和蛋白更稳定,更容易保存。进而保证了检测结果的可靠性。因此,DNA甲基化定量水平的变化对于肿瘤预后、肿瘤化疗后的耐药等提供了新的研究指标,可以从另一个层面上揭示其发生机制。
参考文献
[1] KrugU, GanserA, KoefflerHP. Tumor suppressor genes nnormal and m alignant hematopoiesis. Oncogene 2002; 21: 3475-95.
[2] Mitelman F, Johansson B, Mertens F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nat Rev Cancer, 2007, 7:233-245.
[3] Szczepaski T, van der Velden VH, van Dongen JJ. Flow-cytometric immunophenotyping of normal and m alignant lymphocytes. Clin Chem Lab Med, 2006, 44: 775-796.
[4] Teofili L, Martini M, Luongo M, et al. Hypermethylation of CpG islands in the promoter region of p15(INK4b) in acute promyelocytic leukemia represses p15(INK4b) expression and correlates with poor prognosis. Leukemia 2003;17:919-24.
[5] Christiansen DH, Andersen MK, Pedersen-Bjergaard J. Methylation ofp15INK4B is common, is associated with deletion of genes on chromosome arm 7q and predicts a poor prognosis in therapy-related myelodysplasiaandacute myeloid leukemia. Leukemia 2003;17: 1813-9.
流行病学研究证实,高血压、糖尿病、高脂血症、同型半胱氨酸血症、C反应蛋白增加、纤维蛋白原升高、吸烟、肥胖、呼吸睡眠暂停、长期慢性感染、卒中、反复发作的短暂性脑缺血发作和缺血性心脏病等是血管病变的危险因素,也是CSVD与VaD共同的危险因素?。对CSVD和VaD的危险因素进行遗传学研究,进而对其进行有效干预和一级预防对避免卒中和VaD具有重要意义。
基金项目:国家自然科学基金(1160472);广西科学研究与技术开发计划项目:(桂科攻1550054-5);柳州市科学研究与技术开发计划:(201F010401)11脂质代谢异常脂质代谢异常是CSVD和VaD的共同危险因素。分子遗传学研究发现,胆固醇从头合成的调节剂--固醇转录因子调节元件结合蛋白1等位基因携带者患痴呆的风险更高;在痴呆患者中,胆固醇"24S-羟化酶的水平有显著改变M。而在CSVD中,高胆固醇水平对于脑小血管的影响显而易见,其直接促成脑血管的脂质透明变性,进而引起脑的小血管病变M。
另外一个与痴呆相关的基因是载脂蛋白E4(apolipopro-teinE4,apoE4)的等位基因,它与其他风险因素协同作用直接影响CSVD。上海的一项调查研究证实,VaD患者apoE4出现的频率显著高于正常对照组6。另一项研究表明,apoE4的基因多态性与20%的VaD有关。一项关于中国人VaD与apoE4关联性的荟萃分析表明,apoE4基因多态性与中国VaD患者的发病相关,研究还指出apoE4的等位基因增加患VaD的风险,而apoE的等位基因有防止VaD的作用。
基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)的功能是重构组织损伤和修复过程中的细胞外基质。目前为止,此家族有名成员与VaD相关。与VaD相关的MMP4基因启动子位于(1G/2G,-1607bp),由于鸟嘌呤的插入或缺失,致使2G等位基因和基因型的存在(2G2G和1G2G),进而增强转录相关基因的活性[1647]。研究表明,与AD患者及正常对照组相比,VaD患者脑脊液中MMP~9的水平明显升高,进一步分析发现,MMPs的三种启动子位点合并基因型能增强VaD的易患性。
12血管血压因素脑血管出血或梗死与患者的凝血功能息息相关,纤维蛋白原和凝血因子在其中扮演着重要角色。纤维蛋白原基因多态性基因型A与梗死风险相关,随着纤维蛋白原水平的升高,VaD的风险明显升高。研究表明,纤维蛋白原基因启动子A等位基因将增加腔隙性脑梗死的风险。在凝血因子MVal4Leu的多态性研究中,M的缬氨酸等位基因通过增加纤维蛋白的溶解阻力,增加血栓形成风险。凝血因子V、凝血酶原、纤维蛋白原、纤溶酶激活物 以及其他蛋白抑制剂与非遗传性小血管梗死和VaD的风险相关62。白细胞介素6和细胞间黏附分子1基因的多态性与缺血性脑梗死显著相关,其组合更增加了缺血性脑梗死的发生风险2。血管内皮型一氣化氮合酶有增加不完全皮质下梗死和VaD的风险。关于血管内皮型一氣化氮合酶基因型G94T和94TT的多态性研究表明,两者与亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)的C677TT多态性及血管紧张素转换酶的D/D基因型协同关联,增加缺血性脑梗死的风险,可与高血压、糖尿病、吸烟、酗酒等进一步产生协同效应。
血管紧张素转换酶的D/D基因型和MTHFR的C677TT基因型与不完全皮质下梗死及VaD的发病相关,认为其是脑白质病变的独立危险因素,与脑白质的改变以及认知功能衰退密切相关M。此外,MTHFR的C677TT基因型与血管紧张素转换酶的D/D基因型表现出协同效应。但目前关于血管紧张素转换酶D/D基因型与脑卒中及VaD的研究尚存在争议,这可能是由种族差异或其他协同因素造成的,也可能是样本量的问题。
1炎症与氣化应激因素同型半胱氨酸水平的升高可产生过多的活性氣并抑制一氣化氮合酶,进而造成血管功能障碍;同时同型半胱氨酸又促进脂蛋白a与纤维蛋白结合,产生自由基,促进低密度脂蛋白氣化,进一步导致卒中发作和VaD发生。
MTHFR是同型半胱氨酸代谢的主要酶类之一。MTHFRC677T的多态性与年轻患者的脑缺血相关,其TT型基因与无症状脑梗死及脑白质病变相关2。
血小板内皮细胞黏附分子1是白细胞跨内皮迁移的关键介质,其基因的多态性是冠状动脉疾病与血清血小板内皮细胞黏附分子1水平的共同风险因素,其水平的升高增加了脑梗死的风险,可能与VaD发病及再次加重相关。
谷胱甘肽-转移酶1具有抗氣化应激作用,其外显子4(Ala140Asp和Glu155Glu)是基因的两个错义突变。研究表明,谷胱甘肽-S-转移酶1Ala140Asp多态性降低了酶的活性,降低了抗氣化应激的作用,增加了脑梗死和VaD的易患风险。
14其他研究证实,新发现的17q25基因位点与缺血性卒中的白质高信号相关,特别是与rs994的多态性有关。同时此研究进一步说明,17q25单核苷酸的多态性与腔隙性脑梗死并无关联。虽然17q25基因位点与白质高信号有关,但并不是通过责任血管和小血管促进梗死发生,具体原因还未见相关报道。
最近的一项全基因组关联研究也未发现VaD与散发性CSVD间存在确定的遗传关联。研究表明,肿瘤坏死因子基因的启动子(C-770T的T序列和TTGAT)表达的降低可增加女性患VaD的易患性。非受体酪氨酸激酶SYK基因的内含子的rs290227多态性增加患VaD风险。对血小板白细胞C激酶底物同源性结构域B家族2成员的相关性研究也倾向于其对VaD有遗传易患性。
2单基因遗传性CSVD与VaD的遗传学研究
单基因遗传性CSVD主要有家族性淀粉样脑血管病(familialcerebralamyloidangiopathy,FCAA)、伴有皮质下梗死
和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(cerebralautosomaldominantarteriopathywithsubcorticalinfarctsandleukoen-cephalopathy,CADASIL)、伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体隐性遗传性脑动脉病(cerebralautosomalrecessivearteri-opathywithsubcorticalinfarctsandleukoencephalopathy,CARA-
SIL)、伴视网膜病的遗传性小血管病、弥漫性躯体性血管角化瘤病等。
FCAA是一种因淀粉样蛋白积聚在血管壁导致的卒中和VaD,其至少包括以下几种类型:荷兰型,是由第21号染色体APP695基因的61位密码子发生了G-C的单一位点突变;冰岛型,位于20p112的CC基因外显子CTG突变为CAG,并存在限制性内切酶识别位点的缺失;此外还有Flemish突变、北极型突变、爱何华型突变等。散发性FCAA主要与载脂蛋白E基因、早老素基因、a抗糜蛋白酶基因、脑啡肽酶基因、Ap降解酶以及转录生长因子h等的基因突变有关。
CADASIL的致病基因是Notch基因,现已发现190多种Notch基因多态性与CADASIL有关。Notch基因位于表皮生长因子受体的串联重复区,其基因突变导致半胱氨酸残基的增益和损失,影响血管平滑肌功能和血管内环境的稳定,导致这些血管平滑肌细胞凋亡缺陷,影响微血管功能,继发神经元损伤。
CARASIL的主要症状与CADASIL相似,半数患者有卒中发作,而无卒中症状的患者主要表现为进行性脑功能损害,也可出现精神症状。研究表明,HTRA1基因突变与CARASIL
有关。
伴视网膜病的遗传性小血管疾病主要有种类型,其中遗传性视网膜病未见有痴呆病例报道;伴视网膜■肾病^卒中的遗传性内皮细胞病虽有卒中症状,但也未见痴呆病例报道;大脑视网膜血管病有卒中和痴呆症状。三者的致病基因均定位于p211~p21,属常染色体显性遗传。目前研究认为,伴视网膜病的遗传性小血管疾病致病基因位于p211~p21的DS157~DS564区域,具点尚未见报道。
本文通过近年来发表的相关文献,对NER系统基因XPD单核苷酸多态与肿瘤的遗传易感性进行了综述。
1 XPD基因生物学特征及功能
XPD位于人类染色体19q13.3,长约54.3kb,转录产物大小为2283bp,由760个核苷酸组成,其中42~49位为ATP结合位点;682~695位为潜在的核定位信号。XPD基因包含23个外显子,所有的内含子在结合位点均具一致的GT/AG序列,在该基因上有135个SNPs。XPD是一种进化保守的ATP依赖的DNA解旋酶,是核苷酸切除修复途径中的重要一环,涉及核苷酸切除修复和碱基转录,它是Ⅱ型转录因子H (TFⅡH) 复合体的重要组成部分,一方面参与NER,另一方面还参与转录。大约2/3基因突变位于XPD蛋白的C-末端,而C-末端是与p44的结合区,它们共同构成TFⅡH 复合物[4]。
2 XPD基因单核苷酸多态与肺癌遗传易感性
目前,肺癌是世界上死亡率最高的恶性肿瘤之一。有研究发现XPD基因的rs1799793和rs13181这两个位点的单核苷酸多态性与肺癌发生密切相关[5];同样,Zhan等[6]的Meta分析结果也显示XPD基因的Lys751Gln和Asp312Asn多态性与肺癌发病风险相关,其中Lys751Gln基因型的C等位基因会增加欧美人中吸烟者患肺癌的风险,而Asp312Asn基因型的A等位基因则会增加亚洲人中吸烟者的患病风险;王芳等[7]研究发现XPD基因多态可影响焦炉工DNA损伤水平,但是与肺癌易感性无关联;卢火绲[8]的研究显示XPD751Lys/Lys基因型个体中,吸烟患者更容易罹患肺癌。
3 XPD基因单核苷酸多态与结直肠癌遗传易感性
结直肠癌 (colorectal cancer, CRC) 是世界上常见的恶性肿瘤之一,每年死亡人数达到60万,以新西兰、欧洲及北美等发达国家发病率最高,是非洲及亚洲中部等发展中国家的2~5倍[9]。尽管我国结直肠癌发病率相对较低,但近几年也有明显上升趋势。结直肠癌的发病机制尚未明确,大量的流行病研究结果认为结直肠癌的发生发展与吸烟、酒精、肥胖等危险因素呈正相关。于兆亚等[10]研究显示XPD751基因突变型个体可增加罹患结直肠癌的风险。目前,国内关于XPD Lys751 Gln基因多态性与结直肠癌易感性的研究较多,但研究结果不尽相同,且样本量小,有待进一步验证。
4 小结
综上所述,XPD基因单核苷酸多态与肿瘤遗传易感性关系的研究,应深入评价基因型-表型相关性和基因-基因、基因-环境的交互作用,从而阐明疾病发生的分子遗传学机制,研究和确定与各种疾病易感性相关的危险基因型,将其作为分子标志物用于筛选高危人群或易感个体,同时估计人群发病风险,从而采取有效干预措施,预防肿瘤的发生,对疾病的早期诊断和早期治疗将具有重要意义。
参考文献:
[1]Spencer DM, Bilardi RA, Koch TH, et al. DNA repair in response to anthracyclin-DNA adducts: a role both homologous recombination and nucleotide excision repair[J].Mutation Research,2008, 639 (1-2): 110-121.
[2]Sugakawa K, NgJMY, Matsutani C, et al. Xeroderma pigmentosum group C protein complex is the initiator of global gene nucleotide excision repair [J]. Mol Cell,1998,2 (2): 223-232.
[3]Costa RM, Chigancas V, Galhardo Rdas, et al. The eukaryotic nucleotide excision repair pathway [J]. Biochimie, 2003, 85 (11): 1083-1099.
[4]金玉兰,范雪云.人类DNA修复基因XPD/ERCC2基因多态性与疾病易感性研究进展[J]. 工业卫生与职业病, 2007, 33 (2): 109-112.
[5]Ricceri F, Matullo G, Vineis P. Is there evidence of involvement of DNA repair polymorphisms in human cancer [J]. Mutat Res, 2012, 736 (1-2): 117-121.
[6]Zhan P, Wang Q, Wei SZ, et al. ERCC2/XPD Lys751Gln and Asp312Asn gene polymorphism and lung cancer risk: a meta-analysis involving 22 case-control studies [J]. J Thorac Oncol, 2010, 5 (9): 1337-1345.
[7]王芳,何越峰,等.ERCC2/XPD基因多态性与焦炉工DNA损伤及肺癌易感性的关联研究[J].中国XPD基因单核苷酸多态与肿瘤遗传易感性的研究进展
邝仕成
(海南省人民医院药学部,海南 5703111)
预防医学杂志: 2012, 13 (1): 30-35.
中图分类号r459.9文献标识码a文章编号 1007-5739(2010)01-0025-01
美国是世界上最早开展基因治疗的国家,也是目前开展基因治疗最多的国家。我国在1991年7月开始基因治疗的临床研究,最早的工作是对b型血友病的基因治疗及利用抑癌基因对癌症的基因治疗[1]。基因治疗目前主要用于治疗对人类健康威胁严重的疾病,包括遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等[2]。
1基因治疗的方式
1.1体内基因治疗
体内基因治疗是指将具有治疗功能的基因直接转入病人的某一特定组织中。利用反转录病毒载体已成功地将真核基因转入动物细胞,但通过质粒dna的直接操作,将更加省时而且产量较高;采用温和病毒载体的体内基因治疗主要是通过腺病毒和单纯疱疹病毒来完成的,即将载有矫正基因的载体直接注射入需要这些基因的组织。以腺病毒为载体的体内疗法在遗传性疾病方面,目前主要见于囊性纤维变性的基因治疗研究。多数研究表明,基因治疗纠正了呼吸道上皮的氯离子转运缺陷,使跨上皮基础电位下降,肺功能有所改善[3]。
1.2反义疗法
反义疗法主要是通过阻遏或降低目的基因的表达而达到治疗的目的。反义疗法是通过引入目的基因的rna的反义序列而达到上述目的。当引入的反义rna与mrna相配比后,用于翻译的mrna的量就大大减少,因而合成的蛋白的量也相应大大减少。引入的反义序列也可能与基因组dna互补配对,从而阻遏mrna的转录。这2种情况都会使细胞中靶基因编码的蛋白合成大大减少,以达到基因治疗的目的。
1.3通过核酶的基因治疗
20世纪80年代初,美国科学家cech和altman发现了核酶,核酶是指由rna组成的酶,能够序列特异性地抑制靶mrna。近年来,核酶在抑制癌基因的表达[4]、增强肿瘤对药物的敏感性及抑制肿瘤血管的生成等方面的应用得到了广泛的研究。
1.4自杀基因疗法
自杀基因疗法是恶性肿瘤基因治疗领域最有希望的方法之一,已广泛用于各种恶性肿瘤的基础研究和临床试验性治疗。它是用药物敏感基因转染肿瘤细胞,其基因表达的产物可以将无毒性的药物前体转化为有毒性的药物,影响细胞的dna合成,从而引起该肿瘤细胞的死亡。
2基因治疗存在的问题
2.1基因治疗的社会和伦理问题
基因治疗不仅仅是一种医疗方法,它还涉及很多其他问题。因为当人们试图“纠正”人类自身“不正常”的基因时,这种纠正的后果是无法预料的。由于人类的遗传信息非常复杂,转基因也可能带来不可预料的后果,没有人能保证这种基因结构的改变绝对不会造成人类某一未知功能的缺失。另外,当人们试图把基因治疗引入生殖细胞时,又涉及后代基因结构的改变问题,且改变将直接影响这个“未来人”,这是一个很难解决的伦理问题。
2.2基因治疗的技术问题
目前,基因治疗的对象是单基因的缺陷,但许多疾病涉及多个基因之间复杂的调控和表达关系。对这类疾病的基因治疗难度很大,因为向细胞中导入多个基因后,使几个基因之间能保持正常的调控关系几乎是不可能的。即使是单基因缺陷症,使导入细胞的基因能正常表达也是一个较复杂的问题。将基因导入细胞后,其表达量的多少是直接影响能否达到治疗的目的和有无副作用的关键。但这个问题将会在人类基因组计划完成的基础上,对人类后基因组计划的开展,弄清了人类基因之间复杂的调控联系后而最终得到解决。只有这样,才能在基因治疗中尽量做到使导入的基因处于正确的调控下,取得治疗效果,消除副作用。
3展望
以基因转移为基础的基因治疗要在临床上很好地应用,还有待理论和各种技术的进一步发展。过去20~30年基因治疗的发展已取得了巨大成就,已被看成是对先天和后天基因疾病的潜在有效的治疗方法,不过其依然存在缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达和宿主产生免疫反应等问题。今后基因治疗研究将向2个方向发展:一是基础研究更加深入,以解决在临床应用中遇到的一些困难及基因治疗本身需要解决的一些难点;二是临床试用项目增多,实施方案更加优化,判断标准更加客观,评价效果更加精确。总之,随着分子生物学、分子遗传学以及临床医学的发展,基因治疗也会不断发展,日趋成熟,很多难题会得到解决,并在临床上得到广泛应用。整理
4参考文献
[1] 李立家,肖庚富.基因工程[m].北京:科学出版社,2004.