生物细胞作用模板(10篇)

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篇1

The biological activity and antitumor effect against　lymphoma cells in DCCIK cells

ABSTRACT: Objective To investigate the proliferation activities， phenotype changes， level of secretory cytokines and antitumor activity against lymphoma cells of DCCIK cells in coculture of cytokineinduced killer (CIK) cells with dendritic cells (DC). Methods DC and CIK were prepared from healthy human peripheral blood mononuclear cells. They were cocultured peripherally. CIK cells were cultured alone as controls. Increased number of cells were counted by tapanblue staining， killing activity was detected by MTT assay， cells phenotypes were analyzed by flow cytometry， secretions of INFγ and IL12 were determined by ELISA. Results The proliferation activity of DCCIK cells was significantly higher than that of CIK cells (P

KEY WORDS: cytokineinduced killer cell; dendritic cellscytokine induced killer cell; biological activity; antilymphoma

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinduced killer cells， CIK)是一种体外增殖能力强、杀瘤活性高及对多重耐药肿瘤细胞较敏感的广谱抗瘤免疫活性细胞[1]。树突状细胞(dendritic cells， DC)是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞，可以在体内、外向T淋巴细胞递呈抗原，并诱发细胞毒T淋巴细胞反应[2]。在本研究中，我们通过多种细胞因子组合从正常人外周血中诱导DC、CIK细胞，并将两者共培养，观察DCCIK细胞体外增殖能力、杀伤活性、免疫表型变化及分泌细胞因子水平，旨在为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 rhIL2、RPMI 1640培养基及四甲偶氮唑盐(MTT)均为Sigma公司产品，培养用CD3McAb由Neomarkers公司提供，rhIL1、rhIFNγ、rhTNFα为上海生物制品研究所产品，rhGMCSF为先灵葆雅公司惠赠，rhIL4购自Gibco BRL公司，流式细胞仪标记抗体CD3、CD3CD4、CD3CD8、CD3CD56及检测细胞因子(IL12、IFNγ)的ELISA试剂盒均购自晶美生物工程有限公司，鼠抗人CD1a、CD14、HLADR和FITC兔抗鼠荧光二抗购自中国医学科学院天津血液学研究所。

1.2 靶细胞来源 Raji为人组织淋巴瘤细胞株，引自上海第二医科大学瑞金医院血液学研究所；新鲜淋巴瘤细胞取自外科手术切除的淋巴瘤标本(淋巴结或脾脏)，去除结缔组织和坏死组织，剪成1mm3的组织块，2.5g/L的胰酶消化后过100钢目，经淋巴细胞分离液分离，获得恶性淋巴瘤细胞(malignant lymphoma cells， MLC)，存于液氮中待用。要求靶细胞比例>95%，活体细胞>90%。

1.3 CIK细胞的培养扩增 采集健康人外周血，肝素抗凝，以FicollHypaque淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞(MNC)，RPMI 1640洗3次，调细胞密度为4×106/mL；贴壁培养1-2h，收集悬浮细胞用含10%(体积分数)小牛血清(FSC)的RPMI 1640液调细胞密度为1×106/mL，第0天加入rhIFNγ1000u/mL，放置37℃，5%(体积分数)CO2孵育箱中培养24h后加入rhIL2300u/mL、rhIL1100u/mL、CD3McAb 50μg/L，继续培养，以后每3d更换新鲜培养液，补加rhIL2。

1.4 DC的体外培养 参照文献方法[3]。获得健康人外周血MNC中的贴壁细胞，用含10%(体积分数)FSC的RPMI 1640培养基培养，其中包含rhGMCSF 550u/mL，rhIL4500u/mL。隔日半量换液，补加细胞因子，收获前72h再加入rhTNFα 50u/mL，诱导DC成熟。

1.5 DCCIK细胞的培养 收获培养第9天的DC细胞及CIK细胞经活细胞计数后按1∶5混合培养，第3天和第6天，收集细胞做生物学活性测定。

1.6 细胞毒活性的测定 以不同效靶比(5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1)，把效应细胞和靶细胞放入96孔板，另设单独靶细胞及效应细胞孔，每孔设3个复孔，置37℃，5%(体积分数)CO2孵育箱中培养48h，按本室建立的MTT法[4]测杀伤活性。杀伤活性(%)=[1-(实验组A-效应组A)/靶细胞A]×100%。

1.7 细胞免疫表型的分析 用流式细胞仪检测CIK及DCCIK细胞的免疫表型；间接免疫荧光法测定DC免疫表型。

1.8 细胞因子的检测 收集培养细胞上清液进行IL12、IFNγ水平测定。采用ELISA双抗夹心法，操作按试剂盒说明。

1.9 统计学处理 数据以±s表示，组间比较采用t检验，以P

2 结果

2.1 增殖能力的观察 CIK细胞培养第6天进入显著增殖期，部分细胞体积明显增大，成丛或集落状悬浮生长。与DC共培养可明显提高CIK细胞增殖速率。培养第15天，经台盼蓝排斥法活细胞计数，CIK细胞总数扩增到原来的(43.57±5.11)倍，而DCCIK细胞为(60.75±4.89)倍，两组差异有统计学意义(P

图1 培养时间与增殖倍数的关系（略）

Fig.1 The relationship between the culture time and proliferation fold

2.2 细胞表型的分析

2.2.1 DC的形态及表型检测 培养第9天的DC 细胞在倒置显微镜下可观察到典型的树状或毛刺状突起。检测细胞表面分子表达，其特异性标志CD1a的阳性率为(80.56±1.72)%，MHCI类分子HLADR的阳性率为(92.06±3.20)%，CD14的表达率为(8.69±1.76)%。表明此种方法可以诱导较高纯度的成熟DC。

2.2.2 DC与CIK细胞共培养后的免疫表型 CIK细胞单独培养，随着培养时间的延长，CD3+CD8+及CD3+CD56+细胞的比例逐渐增加。与DC共培养的CIK细胞CD3+CD8+及CD3+CD56+双阳性细胞的比例明显高于同条件下未共培养组(P

2.3 体外细胞毒性 共培养3d的DCCIK细胞，对Raji细胞株及新鲜MLC的杀伤活性均明显高于单纯CIK细胞(P

表1 CIK和DCCIK细胞免疫表型的变化（略）

Table 1 The phenotype changes of CIK and DCCIK cells

*P

表2 DC CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤活性（略）

Table 2 Killing activity of DCCIK cells on MLC and cell line Raji

2.4 细胞因子的测定 DC与CIK细胞共培养3d，其上清液中IFNγ、IL12的水平分别为(438.02±213.17)ng/L和(30.65±9.10)ng/L，而同条件下，CIK细胞组IFNγ为(213.96±137.00)ng/L，IL12为(10.10±0.35)ng/L，两组相比，DCCIK细胞分泌IFNγ、IL12的水平显著高于CIK细胞(P

3 讨论

CIK细胞是由多种细胞因子如IL2、IFNγ和CD3单克隆抗体等诱导的一种免疫活性细胞，其兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性与NK细胞的非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤特点[5]。DC摄取、加工、处理抗原，高表达MHCI、MHCⅡ类分子、共刺激分子及黏附分子，在体内外具有激发初次和继发性T细胞免疫应答功能，并能分泌Th1型细胞因子IL12，诱导T细胞和NK细胞产生IFNγ和增强激活NK细胞的细胞毒活性。为此，将具有高效杀瘤活性的CIK细胞和具有强大肿瘤抗原递呈能力的DC共培养，无疑会起到一定的抗肿瘤协同作用。研究发现DC刺激CIK细胞后，细胞毒活性显著增强[6]。本实验显示DC、CIK细胞一起培养后，共培养物DCCIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤作用显著高于同条件下单纯CIK细胞。虽然与文献报道[67]有关DCCIK细胞来源、制备方法、效靶比、效靶细胞作用时间以及靶细胞种类不尽相同，但DCCIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤活性与文献中DCCIK细胞对胰腺癌细胞DANG及CML细胞的杀伤活性强于CIK细胞的结论相同。证实DCCIK细胞确实具有比CIK细胞更强的抗肿瘤活性。CIK细胞属于异质细胞群，其抗肿瘤作用与CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞及分泌细胞因子的水平密切相关。将DC、CIK细胞一起培养后，两者所分泌的细胞因子及表面分子表达发生了变化。研究发现DC与CIK细胞共培养时，DC成熟表面标志CD86、CD80、CD40、HLADR的表达增加[8]。而CD4+CD25+细胞(调节细胞T细胞)和IL10水平下降，对肿瘤细胞的细胞毒活性增强[9]。负载CA199(肿瘤相关抗原)的DC与CIK细胞混合培养24h后IL12的分泌量为CIK细胞单独培养时6.93倍[7]。DC的抗原提呈作用能使CIK细胞分泌IFNγ的时间延长，分泌量增加[10]。我们的实验显示，共培养条件下，DCCIK细胞上清液中IL12、IFNγ分泌量均比同条件下单纯CIK细胞培养分泌高，且CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞比例也比CIK细胞组显著增多。说明DCCIK细胞的高杀伤活性与大量增殖的CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞有关，细胞因子IL12、INFγ对杀伤肿瘤也发挥了直接和间接的重要作用。DC能够激活CIK细胞增殖。与DC共培养14d后CIK细胞的增殖倍数比共培养7d时高出两倍左右[7]。本研究结果表明，共培养DCCIK细胞不仅具有很强的杀瘤活性，且比同源CIK细胞具有更强的增殖速率，共培养6d，DCCIK细胞总数比单独培养CIK细胞总数多扩增了17倍。说明利用共培养条件可提高CIK细胞的增殖能力，获得大量高效的免疫细胞，这对于肿瘤临床具有重要意义。本研究初步证实，DCCIK细胞增殖活性、抗淋巴瘤作用均高于单纯CIK细胞，这为其临床应用治疗或辅助治疗淋巴瘤提供了实验和理论依据。

基金项目：陕西省“三五人才工程”专项基金资助项目

【参考文献】

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篇2

Anti-proliferation Effect of Phosphorylated Chrysin Derivatives in Leukemia Cells/FU Yun-bi，LIU Zhi-he，PENG Ai-yun.//Medical Innovation of China，2015，12（16）：120-123

【Abstract】 Objective：To investigate the anti-proliferation effect of a series new phosphorylated chrysin derivatives in leukemia cells.Method：The cell viability of the 12 phosphorylated chrysin derivatives in Kasumi-1 cells was detected by MTT assay，and the derivatives with higher proliferation inhibition rate than chrysin were selected out to process the next step to verify the anti-proliferation effect in K562 cells，HL60 cells，U937 cells，and bone marrow mononuclear cells （BMMNC） from acute leukemia patients.Result：Chrysin derivatives 3c and 7a could inhibit the proliferation of leukemia cells in vitro.Conclusion：The new phosphorylated chrysin derivatives 3c and 7a have potential value in anti-leukemia research.

【Key words】 Chrysin； Leukemia； Proliferation inhibition

First-author’s address：The 4th Hospital Affiliated to Medicine College of Ji’nan University，Guangzhou 510220，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.16.044

黄酮类化合物广泛存在于自然界的某些植物和浆果中，是药用植物中的主要活性成分之一，亦是人类饮食中的重要组成部分。黄酮类化合物以其广谱的药理作用尤其是抗肿瘤作用引人瞩目[1-3]。近年来世界上掀起了黄酮类化合物开发的热潮。白杨素（chrysin）是被广泛研究的黄酮类化合物之一，其来源于紫葳科植物木蝴蝶的种子、茎皮，松科植物山白松的心木，芒松的心木等，在蜂胶中的含量较高，是蜂胶的主要有效成分。白杨素的化学名为5，7-二羟基黄酮。研究证明，白杨素具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗高血压、抗糖尿病、抗菌、抗过敏等多种药理作用[4]。本研究旨在探讨新合成的一类膦（磷）酰化白杨素衍生物在体外对白血病细胞的增殖抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Kasumi-1细胞株、K562细胞株、HL60细胞株、Jurkat细胞株、NB4细胞株及U937细胞株购中国科学院上海细胞库，白杨素含膦（磷）衍生物由中山大学化学与化学工程学院彭爱云提供。PRMI-1640培养基购自美国Gibco公司，新生牛血清从杭州四季青生物工程材料有限公司购买，甲基亚砜（DMSO）购自美国Amresco公司。

1.2 白杨素含膦（磷）衍生物的合成 以白杨素为先导化合物，按步骤1和步骤2所示的合成路线（图1），经膦（磷）酰化结构修饰后合成新的系列白杨素含膦（磷）衍生物。结构经核磁、红外、质谱等确证，纯度经高效液相色谱鉴定。化合物合成由中山大学化学与化学工程学院合成。

1.3 细胞培养及原代细胞分离 细胞株用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养基，加1×105 U/L青霉素、1×105 U/L链霉素，在37 ℃、95%饱和湿度和5% CO2条件下培养，1～2 d换液1次。

选取根据MIC分型诊断为急性白血病的初诊患者，抽取骨髓5 mL，分离单个核细胞（BMMNCs）。共分离10例急性白血病患者的BMMNCs。

1.4 MTT实验 取指数生长期细胞或BMMNCs，实验在96孔培养板中进行，每孔加入100 μL细胞悬液（2×104个细胞），100 μL用培养基稀释的药物。白杨素为阳性对照组、设溶媒对照组及调零组，每组3孔，培养一定时间后，实验组及对照组每孔加入20 μL MTT液（5 g/L），调零组加入无血清PRMI-1640培养基，混匀，继续培养6 h，离心去清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，EX-800型酶标仪以450 nm波长测定OD值，计算相对细胞活力，细胞活力（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%，重复3次实验。

图1 白杨素含膦（磷）衍生物的合成

1.5 统计学处理 使用SPSS 11.5软件进行统计学分析，计量资料数据以（x±s）表示，采用t检验，P

2 结果

2.1 白杨素含膦（磷）衍生物的结构及理化性质 合成了12个白杨素膦酸单酯（3aC3l），6个白杨素膦酸（4aC4f），1个白杨素膦（磷）酸6和2个白杨素膦（磷）酸单酯7a，7b，共21个化合物。结构见图2。该类化合物是未见文献报道的新化合物，其构效关系显示有更强的抗肿瘤活性、较好的水溶性、更高的生物利用度，其结构经核磁、红外、质谱等确证，纯度经高效液相色谱鉴定，均达到99.5%以上，溶解度经高效液相色谱法测定为52.3-138.6 μm。

图2 白杨素含膦（磷）衍生物

2.2 白杨素含膦（磷）衍生物对Kasumi-1细胞增殖抑制活性筛选 为了筛选出增殖抑制活性较强的化合物，参照文献[5]报道先导化合物――白杨素抑制细胞活性的有效浓度，并以其作为阳性对照，12个化合物分别以100 μm作用细胞48 h，MTT试验检测细胞活性。结果见表1，衍生物3c、3e、3j、4b、7a、7b对Kasumi-1细胞有一定的增殖抑制活性。其中衍生物3c、7b对细胞的抑制活性远远高于先导化合物白杨素，比较差异有统计学意义（P

表1 白杨素膦（磷）酸衍生物对Kasumi-1细胞的增殖抑制率

化合物 增殖抑制率（%） 化合物 增殖抑制率（%）

3a 0.52±12.6 3l 3.19±13.43

3b -5.68±9.52 4a 16.40±13.17

3c 82.64±4.08 4b 36.09±6.48

3d 7.83±7.81 4c 9.25±17.13

3e 46.36±15.96 4d 1.74±6.39

3f 1.62±5.71 4e 0.08±8.64

3g 10.46±13.19 4f -6.99±13.36

3h 15.24±19.41 6 9.09±8.93

3i 16.42±7.95 7a 79.23±5.01

3j 42.89±7.93 7b 31.97±14.61

3k 8.07±14.65 Chrysin 47.39±6.03

以白杨素（chrysin）为对照，100 μm的3c、7a分别作用Kasumi-1细胞0、12、24、36、48、60 h，结果见图3。100 μm的3c作用36 h细胞活性最低，100 μm的7a作用48 h细胞活性最低。衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞增殖抑制活性呈时间依赖性，且均强于白杨素，比较差异有统计学意义（P

图3 白杨素含膦（磷）衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞增殖抑制的时效关系曲线

2.3 白杨素含膦（磷）衍生物3c、7a对多个白血病细胞株的增殖抑制活性 为了探讨衍生物3c、7a对其他白血病细胞株的活性，选用衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞株有效作用时间及浓度，分别作用于Jurkat细胞株、NB4细胞株、K562细胞株、HL60细胞株及U937细胞株，MTT法检测细胞活性。结果见图5、图6。衍生物3c、7a对以上细胞株的增殖均有明显的抑制作用，且呈时间及浓度依赖性。与对照组比较，作用时间48 h时，25 μm衍生物3c即对U937细胞产生明显的增殖抑制作用；50 μm浓度时对Jurkat细胞株、NB4细胞株、K562细胞株及HL60细胞株有明显的增殖抑制作用，差异具有统计学意义（P

2.4 白杨素含膦（磷）衍生物3c、7a对AML患者BMMNCs的增殖抑制作用 10例初诊的急性白血病，其中M2a 4例，M5 1例，B-ALL 2例，T-ALL 2例，慢粒急变1例，分离骨髓单个核细胞，用不同浓度的白杨素含膦（磷）衍生物3c或7a处理48 h，取10例患者各浓度的OD值平均数做曲线，结果见图7。与细胞株结果类似，衍生物3c及7a对急性白血病患者的骨髓原代细胞均有明显的增殖抑制作用，且为浓度依赖性。

3 讨论

许多研究者对从植物中筛选出的天然黄酮类化合物（如葛根总黄酮、姜黄素、金莲花黄酮、染料木黄酮等）进行了广泛研究，发现其在体内外对多种白血病细胞均有一定的活性[6-7]，但是天然黄酮存在活性偏低、类药性差等缺点。为了提高其抗肿瘤活性，适应临床应用，各种各样的黄酮衍生物被合成[8-9]。文献报道最成熟的为国外研究者合成的Flavopiridol（夫拉平度，黄酮 L86-8275），Ⅰ期或Ⅱ期临床试验已证实此药单用或与其他化疗药物合用对难治复发性急性或慢性白血病均有肯定疗效[6，10]。

图5 白杨素含膦（磷）衍生物3c对各细胞株的增殖抑制活性

注：A：0、25、50、75、100 μm的3c作用各细胞株48 h；B：100 μm的3c、作用各细胞株0、12、24、36、48、60 h

图6 白杨素含膦（磷）衍生物7a对各细胞株的增殖抑制活性

注：A：0、25、50、75、100 μ的7a作用各细胞株48 h；B：100 μm的7a、作用各个细胞株0、12、24、36、48、60 h

近年来许多国内外学者对白杨素衍生物的合成方法和生理活性进行了研究，对白杨素进行硝化、烷基化、羟甲基化、氟甲基化、膦（磷）酰化后合成的部分衍生物具有较强的抗肿瘤活性，在体外对许多肿瘤细胞都有明显的增殖抑制作用，如人胃癌SGC-7901 细胞、人肺癌A549 细胞、人肝癌HepG2细胞及HepB3细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人鼻咽癌CNE-2细胞、人结肠癌（HT-29）细胞、人类小细胞肺癌NCI2H446细胞、人急性粒细胞性白血病HL-60细胞、人急性T淋巴细胞白血病Jurkat 细胞、急性白血病（M5）U937细胞等[5，11-13]。白杨素膦（磷）酰化结构修饰的报道较少，陈晓岚等[14]对白杨素进行了含膦（磷）改造，共合成出4种新的化合物，他们的研究结果表明，白杨素含膦（磷）衍生物与溶菌酶具有更强的亲和力。张婷等[15]合成了白杨素四乙基二膦（磷）酸酯，并发现白杨素和白杨素四乙基二膦（磷）酸酯对宫颈癌Hela细胞软琼脂的集落形成有明显抑制作用，能诱导并促进宫颈癌Hela细胞发生分化，且白杨素四乙基二膦（磷）酸酯在作用效果方面较白杨素明显，该研究提示膦（磷）酸基团的添加增强了抗肿瘤活性。

笔者通过化学法，将膦酸或膦（磷）酸基团引入到白杨素侧链中，新合成21个未见文献报道的白杨素含膦（磷）衍生物。这些白杨素含膦（磷）衍生物具备以下优点：（1）它们较白杨素具有更好的水溶性。预期在体内能较好的被吸收，可以弥补大多数天然黄酮因水溶性较差而导致生物利用率低的不足。（2）含膦（磷）基团是一些抗骨质疏松、抗病毒、抗肿瘤等药物分子的药效团，白杨素又具有广泛生物活性，所合成的白杨素含膦（磷）衍生物应用了药效团拼合原理，可能具有更好的药理活性。通过体外细胞增殖抑制试验，从新合成的白杨素含膦（磷）衍生物中筛选出对急性白血病（M2）细胞株Kasumi-1增殖抑制作用较强的2个衍生物（3c、7a），这两个化合物100 μm浓度作用48 h对白血病细胞的增殖抑制率分别为82.64%、79.23%，白杨素同等条件下对白血病细胞的抑制率为47.39%。此后，用衍生物3c及7a分别处理多个细胞株及急性白血病患者的骨髓原代细胞，发现，白杨素含膦（磷）衍生物3c及7a对检测的多个白血病细胞株及患者骨髓原代细胞均有明显的增值抑制作用，说明该两个衍生物有体外抗白血病活性，有进一步进行体内抗肿瘤活性研究的价值。

参考文献

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篇3

【关键词】 巨噬细胞; γ射线; LPS; S100A8

巨噬细胞在整个免疫反应中起极为重要的作用， 辐射后许多组织和器官损伤都涉及到巨噬细胞的功能异常， 巨噬细胞的辐射效应一直受到重视。巨噬细胞通常具有辐射抗性， 但已有多篇报道证明电离辐射能够促进或直接激活巨噬细胞。一氧化氮（nitric oxide， NO）的生成是巨噬细胞被激活的重要标志， 单纯的射线不能引起小鼠巨噬细胞J774.1和RAW264.7细胞中NO水平的改变， 但0.5～10 Gy 射线预处理能够触发这些巨噬细胞为干扰素γ（interferonγ， IFNγ）和（或）脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）诱导生成NO， 而且呈现剂量效应关系［1］。

钙结合蛋白S100A8是S100蛋白家族成员， 是一个多功能分子， 其最主要的功能是参与免疫炎症反应过程［2］。Stassen等［3］研究发现， 6 Gy X射线照射MCF7细胞后48～72 h， S100A8被诱导表达， 其 mRNA水平呈现辐射剂量效应关系。静息态的巨噬细胞不表达S100A8， 激活状态的巨噬细胞才表达S100A8分子， S100A8在巨噬细胞中为LPS等炎症因子诱导表达［4］。既然S100A8能够为电离辐射及LPS诱导表达， 那么我们需要进一步研究在巨噬细胞中， 电离辐射是否与LPS协同诱导S100A8以及S100A8的表达与巨噬细胞功能状态之间的关系。本研究观察比较了RAW264.7细胞受10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h与正常对照、 相应单纯γ射线或单纯LPS处理组细胞形态、 周期、 活性氧介质（reactive oxygen intermediates， ROI）水平、 NO水平及S100A8 mRNA等指标的改变并探讨相互之间的关系。

1 材料和方法

1.1 材料 试剂LPS、 2’7’二氯荧光素双醋酸盐(2， 7dichlorofluorescin dictate， DCFHDA)、 碘化丙啶(propidium iodide， PI)为美国Sigma公司产品。RPMI1640培养基干粉、 胎牛血清、 TRIzol试剂为美国Invitrogen公司产品。随机引物、 MMLV逆转录酶为美国Promega公司产品。BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit为杭州博日公司产品。FACS Calibur 流式细胞仪为美国BD公司产品。Linegene荧光定量PCR检测系统为杭州博日公司产品。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7细胞培养及处理 小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 37℃、 50 mL/L CO2饱和度条件下培养。对数增殖期细胞照射前24 h， 换新鲜培养基， 不辐射或10 Gy 60Co γ射线照射， 照射后24 h， 不加或加入5 mg/L LPS， 继续培养24 h。相差显微镜观察细胞形态变化。

1.2.2 流式细胞术测定细胞周期 乙醇固定骨髓单细胞悬液， PI染色， 流式细胞仪检测， 具体按文献［5］进行。

1.2.3 流式细胞术测定ROI水平 约1×106 RAW264.7细胞铺种于6孔板中， 培养过夜， γ射线或(和)LPS处理后不同时间收集细胞， 用无血清RPMI1640培养液洗2遍细胞后， 20 μmol/L DCFHDA悬浮细胞， 37℃孵育30 min， 无血清RPMI1640培养液洗涤1遍后， 0.5 mL无血清RPMI1640培养液悬浮细胞， 流式细胞仪检测。

1.2.4 NO水平检测 通过Griess颜色反应测定细胞培养上清中NO-2水平， NO-2水平以吸光值A550表示， 具体方法参照文献［1］进行。

1.2.5 实时定量RTPCR检测S100A8表达 用 TRIzol试剂提取RAW264.7细胞总RNA， 经紫外分光仪检测A260和A280， 测定浓度和纯度。取总RNA 2 μg， 随机引物0.5 μg， M MLV逆转录酶200 U， 进行25 μL体系反转录。每PCR反应取2 μL反转录产物为模版， 加入BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit试剂， 于荧光定量PCR检测系统进行实时定量PCR扩增测定CT（Treshhold cycle）值。小鼠S100A8上游引物5′ATCACCATGCCCTCTACAAGA3′， 下游引物5′TGCTACTCCTTGTGGCTGTCT3′。看家基因3磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase， GAPDH）上游引物5′CCATGGAGAAGGCCGGGG3′， 下游引物5′CAAAGTTGTCATGGATGACC3′。用比较CT方法， 以看家基因GAPDH为内参， 以未处理正常细胞中S100A8 mRNA水平为1， 相对定量γ射线或(和)LPS处理后S100A8 mRNA的表达水平。相对表达倍数=2^(-CT)， 其中CT=γ射线或(和)LPS处理样品的CT -正常对照的CT， CT=S100A8的CT-GAPDH的CT 。

1.2.6 统计学分析 所有数据均以x±s表示， 应用SAS9.13统计软件进行两因素析因设计资料的方差分析。

2 结果

2.1 RAW264.7细胞形态学改变 观察比较RAW264.7细胞受10 Gy γ射线照射后24 h， 5mg/L LPS继续处理24 h与正常对照、 相应单纯γ射线或单纯LPS处理组细胞形态学变化， 可见正常RAW264.7细胞为圆形， 贴壁生长; 单纯γ射线或单纯 LPS处理的细胞变大， 部分细胞伸出伪足、 呈梭形， 胞内颗粒增多， 两种处理细胞形态学改变类似; γ射线与 LPS共同作用的细胞变得更大， 胞内大量颗粒物， 巨噬细胞呈现被激活状态。

2.2 RAW264.7细胞倍性、 凋亡的改变 正常未处理的RAW264.7细胞中非整倍性（aneuploid）细胞、 凋亡细胞百分数均为0%; 10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h及相应单纯γ射线或单纯LPS处理条件下， 细胞均出现部分非整倍性细胞; 而只在γ射线与LPS共同作用条件下， 细胞才出现明显凋亡（图1）。

2.3 RAW264.7细胞胞内ROI水平的改变 观察10 Gy γ射线照射后0～24 h胞内ROI水平的动态变化， 照后即刻开始升高， 6 h达高峰， 24 h基本恢复到正常水平（图2）， 可见胞内ROI早期生成明显， 随后下降， 因此我们比较细胞受各种处理后6 h， 胞内ROI水平的改变。单纯10 Gy γ射线照射后30 h（即10 Gy γ射线照射后24 h， 0 mg/L LPS继续处理6 h）， 胞内ROI水平不变; 单纯5 mg/L LPS处理后6 h（即0 Gy γ射线照射后24 h， 5mg/L LPS继续处理6 h）， 胞内ROI水平升高; 10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理6 h， 胞内ROI水平明显升高， 从测定数值看， 明显高于单纯5 mg/L LPS处理后6 h或单纯10 Gy γ射线照射后胞内ROI的水平（图3， 图2）。图2 10 Gy γ射线照射后0～24 h胞内ROI水平的变化

2.4 RAW264.7细胞NO水平的变化 单纯γ射线照射， 胞内NO水平不变; 单纯LPS处理条件下， 与正常对照相比， 胞内NO水平升高; 10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h， 胞内NO水平明显升高， 而且高于单纯LPS处理组， 表明γ 射线能够促进LPS增强巨噬细胞RAW264.7中NO水平（图4）。

2.5 RAW264.7细胞中S100A8 分子mRNA表达水平的改变 实时定量RTPCR方法检测胞内S100A8 mRNA水平的变化。以未处理正常细胞中S100A8 mRNA水平为1， 单纯10 Gy γ射线处理条件下， 胞内S100A8 mRNA水平为9.0±2.3; 单纯5 mg/L LPS处理条件下， 胞内S100A8 mRNA水平为86.0±8.3; 10 Gy γ射线与5 mg/L LPS共同作用条件下， 胞内S100A8 mRNA水平为630.0±70.8。可见， γ射线、 LPS均可诱导巨噬细胞RAW264.7中S100A8 mRNA表达， LPS的作用强于γ射线， 而且γ 射线与LPS具有协同作用。

3 讨论

我们的研究表明， RAW264.7细胞受10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h条件下， γ射线与LPS共同作用影响细胞多方面的生物学效应， 具体表现为细胞体积明显变大， 胞内大量颗粒物， 呈现被激活状态; 部分细胞呈现非整倍性， 少量细胞出现凋亡; 胞内ROI水平、 NO水平明显升高; S100A8 分子mRNA水平明显升高， 而且这些效应几乎都比γ射线或LPS单因素的作用要强。

γ射线与LPS共同作用使RAW264.7细胞形态改变， 胞内大量颗粒物的出现可能反应了细胞酶活性的改变。我们检测了RAW264.7细胞受0～40 Gy γ射线照射后0～72 h细胞倍性、 周期、 凋亡的改变， 发现随时间、 剂量不同， 细胞周期呈动态改变， 但细胞几乎不出现凋亡， 只在γ射线与LPS共同作用条件下细胞才出现凋亡， 一定程度说明细胞具有辐射抗性; 部分细胞呈现非整倍性， 而且这部分细胞DNA含量为正常未处理细胞的两倍， 非整倍性的出现可能与细胞分裂受到抑制、 细胞功能的改变或细胞分化状态相关。

ROI和DNA损伤是辐射信号转导中的主要信使分子。我们观察到0～40 Gy射线照射后6 h， RAW264.7细胞胞内ROI水平随照射剂量增加呈现增强趋势， LPS能引起胞内ROI水平升高， 而且 射线的预处理大大增强了LPS引起细胞ROI水平升高的效应。已有的研究表明， 0～10 Gy γ射线照射后24 h， RAW264.7细胞的DNA损伤随受照剂量增加而增强［6］。在 射线促进IFNγ引起J774.1细胞中NO生成的过程中， 第二信使是DNA损伤而非ROI［1］。

S100A8能够为辐射诱导表达， 紫外线诱导小鼠表皮角化细胞中S100A8的表达， ROI参与了此过程［7］。此外， 大鼠肝部受20 Gy射线照射后6 h S100A8蛋白水平升高， 而且该分子的诱导表达可能与受辐射后肝部ROI水平升高有关［8］。我们的研究发现， 单纯γ射线或单纯LPS处理条件下， RAW264.7细胞中S100A8 mRNA水平升高， 而且γ 射线与LPS具有协同作用。我们还检测了通常与S100A8形成复合物行使生物学功能的S100A9分子mRNA的表达， 未能检测到各种处理条件下该分子的表达及变化， 这与已有报道的研究结果一致［3， 4， 7， 8］， 说明S100A8本身具有功能特异性。我们的预实验表明， ROI及转录因子激活蛋白1(activator protein1， AP1)可能参与了辐射诱导RAW264.7细胞中S100A8表达的过程。S100A8与炎症反应密切相关， 那么S100A8诱导表达可能与RAW264.7细胞活性增强有关。此外， S100A8/A9复合物及S100A8、 S100A9具有抑制细胞增殖、 诱导细胞凋亡的功能［9］， γ 射线与LPS能够增强RAW264.7细胞中S100A8表达、 引起该细胞凋亡， 两者之间是否存在某种关联还需要进一步的实验验证。

参考文献

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篇4

[中图分类号]R 783.1[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.01.009

Biological effects of nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite on the osteoblastsDeng Xia1, Xia Xi2.（1. Dept. of Stomatology, Nuclear of Industry 416 Hospital, Chengdu 610051, China; 2. Dept. of Prosthodontics, The Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 400015, China）

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the biological effects of nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite（nHA-PEA）on the osteoblast.MethodsThe Dulbecco minimum essential medium（DMEM）leaching liquor of nHA-PEA was applied to the osteoblasts of the test groups while the DMEM itself was applied to control. The methyl thiazolyl tetrazolium assay, flow cytometry and alkaline phosphatase（AKP）analysis were used to evaluate the changes in cell growth, cell cycle and cell function. Moreover, osteoblasts were cultured on the surface of nHA-PEA composite and the attachment, growth and proliferation of osteoblast were investigated. Results The cultured osteoblasts grew well and showed nomorphological variation. Osteoblasts of different test groups demonstrated relative proliferation rate ranging from 92%～107% without dose-dependent effect（P>0.05）. The cell cycle and AKP activity were similar in test and control groups（P>0.05）. Good cell attachment and proliferation manner were observed on the membranes. ConclusionnHA-PEA has no negative effects on the osteoblast and its osteoblastcompatibility is proved.

[Key words]nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite；osteoblast；biocompatibility

有机-无机复合生物材料是组织工程学研究的热点[1]，该材料主要用于修复和重建人体的硬组织。纳米羟磷灰石-脂肪族聚酯酰胺（nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester -amide composite，nHA-PEA）复合材料由nHA粒子与PEA均匀混合制得，其中羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）是人体骨、牙等无机组织的主要成分，PEA及其共聚物是一类新型的生物可降解高分子材料[2]。nHA- PEA复合材料兼具了有机物的韧性和无机物的刚性，具有良好的理化性能。本研究将nHA-PEA复合材料作用于体外培养的成骨细胞，检测其对细胞生长、增殖能力、细胞周期、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性的影响，观察细胞在其表面的黏附、铺展形态，评价其对骨细胞的相容性和生物活性。

1材料和方法

1.1主要材料和仪器

达尔贝科极限必需培养液（Dulbecco minimum

essential medium，DMEM）、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），新生小牛血清（成都哈里生物工程有限公司），甲噻唑四唑氮（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂（Sigma公司，美国），AKP试剂盒（北京柏定生物工程有限公司）。Sanyomco-17AI二氧化碳孵箱（Sanyo公司，日本），Olympus IX50相差倒置显微镜（Olympus公司，日本），JSM-5900LV型扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM；JEOL公司，日本），可见光高效分析仪/HTS 7000plus多孔板紫外/荧光（PE公司，美国），流式细胞计数（flow cytometry，FCM；Coulter公司，美国），LightCycler检测仪（Roche公司，德国）。1.2浸提液制备

按文献[3]制得4组nHA-PEA复合材料，按其无机和有机成分的质量分数分组，分别为A组0和100%，B组10%和90%，C组20%和80%，D组30%和70%。将4组nHA-PEA复合材料（平均厚度0.5～1 mm）消毒灭菌后，按照国际标准化组织ISO 10993-5医疗器械生物学评价标准所推荐的试样表面积和浸提介质为6 cm2·mL－1的比例[4]，置37℃滤除细菌的培养液中，浸提3～4 d的浸提液备用。

1.3成骨细胞培养和细胞悬液的制备

取生长稳定的第4代SD乳鼠颅骨成骨细胞，经质量分数0.25%的胰酶消化后行细胞计数，用DMEM配制5×104个每毫升的细胞悬液。

1.4甲噻唑四唑氮比色

将200μL密度为5×104个每毫升的细胞悬液加入96孔板，置于体积分数5%的二氧化碳培养箱，37℃培养24 h，细胞贴壁后弃掉原有培养液，将细胞分为试验组（A～D）和对照组（E），试验组每组均分别加入200、100、50μL终质量分数分别为100%、50%和25%的浸提液，形成A1、

A2、A3，B1、B2、B3，C1、C2、C3，D1、D2、D3，

对照组加入原培养液。每日于相差显微镜下观察细胞形态，生长和增殖情况。分别于第1、3、5、7 d各取96孔板1块，每孔加入20μL的MTT，孵育4 h，每孔加入200μL二甲基亚砜，振荡1 min，混匀，570 nm波长下测定各孔吸光度（A），取3孔均值，计算细胞增殖率（proliferation rate，RP）：RP=（A试验组/A对照组）×100%。1.5流式细胞计数

接种对数生长期的成骨细胞1×105个每毫升瓶，细胞贴壁后A～D组弃原培养液加入质量分数均为100%的复合材料浸提液，E组加入新鲜原培养液，标准环境下3 d换液1次，培养7 d，消化、离心并收集沉淀细胞。流式细胞计数DNA荧光强度及散光参数，Multicycle软件分析细胞的周期分布和程序性死亡情况。1.6碱性磷酸酶活性检测

取1×105个每毫升的细胞悬液3 mL加入小号培养瓶，将其置于体积分数5%的二氧化碳培养箱，37℃培养24 h，细胞贴壁后弃掉原有培养液，A～D组均加入质量分数100%的浸提液，E组加入新鲜原培养液，分别于第4天和第7天中止培养，收集80μL细胞悬液，以AKP试剂盒通过HTS 7000plus多孔板高效分析仪行AKP活性测试。

1.7成骨细胞与材料的复合培养

将载有nHA-PEA复合膜的血盖片试样置于6孔板内，环氧乙烷冷消毒，磷酸缓冲盐溶液浸泡清洗3次，每次1 h，DMEM孵育过夜备用。取1×105个每毫升的细胞悬液，分别接种于已准备好的材料上，37℃，体积分数5%的二氧化碳孵箱继续静置培养5 d。分别于第1天和第5天将试样取出，以体积分数10%的多聚甲醛固定，体积分数30%～100%的乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯置换乙醇，临界点干燥，表面喷金，SEM下观察。1.8统计学分析

使用单因素方差分析，分析各组总体均数间差别有无统计学意义，在检验数据之前对数据行方差齐性检验。用q检验比较两组间均数的差别。P>0.05为差异无统计学意义。

2结果

2.1细胞生长观察及甲噻唑四唑氮比色结果

显微镜下，不同质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液组及对照组细胞培养6 h后均已贴壁，12 h细胞突逐渐舒展，24 h细胞开始铺展，72 h后细胞数目明显增多，排列规则密集，细胞呈梭形、三角形或不规则形，形态分析各试验组与对照组细胞形态相似，显示各组细胞均生长良好。试验组和对照组不同时间的MTT比色结果见表1。试验组间的MTT值及其与其对照组间的差异无统计学意义（P>0.05）；试验组成骨细胞的相对增殖率为92%～107%，不同质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液组对成骨细胞的细胞毒性级数为0～

1级（0级：细胞相对增殖率大于等于100%，1级：细胞相对增殖率为90%～99%）[5]，不同质量分数浸提液组间差异无统计学意义（P>0.05）。

3讨论

在生物医学材料的细胞毒性试验方法中，最常用的是材料浸提液培养法和细胞材料直接接触法。本试验综合运用了这两种方法，首先选择浸渍法，具体原因如下。1）对于nHA-PEA复合材料，nHA的生物相容性勿庸置疑；而PEA是新型的人工合成的生物降解型高分子材料，其理化性能和降解性能已有相关研究[6]，但其生物相容性鲜有报道。2）由于直接接触法共同培养时，细胞对材料表面和对培养孔板底部的黏附性有差异，细胞洗脱率的不同会产生干扰而使试验复杂化。事实上，仅需考察nHA-PEA复合材料溶出物的

细胞毒性，就可以达到初步评价其生物相容性的目的，而且以材料的浸提液代替材料本身在材料学的研究中已得到公认。本试验严格按照国际标准化组织ISO 10993-5医疗器械生物学评价标准和要求制备生物医学材料浸提液[4]，以浸提出最大量的滤出物质，考察其对成骨细胞增殖和细胞周期的影响。

MTT比色是常用的细胞增殖能力检测方法，可以对材料的细胞毒性作出可靠的定量评价[5]。本试验在相差倒置显微镜下观察到nHA-PEA复合材料浸提液不影响细胞的生长形态；MTT值在试验组间以及各组与对照组间差异无统计学意义，试验组的细胞增殖率在92%～107%，表明nHA-PEA复合材料浸提液对成骨细胞的生长无不良影响。因此在进一步地对细胞周期和功能进行的分析中，仅选用最高质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液作为试验组进行分析比较。在加入HA的试验组，MTT值略高于对照组，但差异无统计学意义且无量效关系。原因可能与其中的钙、磷水平较高有关。

流式细胞计数已广泛应用于肿瘤学、生物化学和免疫学等领域，细胞周期检测已成为生物材料生物相容性评价的一种可靠方法和指标[7]，是常规细胞增殖试验的一项重要补充。近年来，生物材料生物相容性研究进展之一是生物材料的生物功能性评价[8]。生物材料作用于细胞后使其周期改变，从而使其行为和功能发生改变。本试验在MTT比色的基础上进一步使用流式细胞计数，旨在从细胞增殖周期的角度来分析nHA-PEA复合材料浸提液对细胞增殖周期DNA合成的影响，从分子水平上评价材料的细胞毒性。从MTT比色可见，组间、组内不同质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液对成骨细胞的增殖和增殖周期影响不大，细胞周期各亚期组成比和程序性死亡率差异亦无统计学意义。B、C、D组处于S期的细胞略多，表明加入HA对细胞增殖有一定促进作用，但不显著，不存在量效关系。此结果与MTT比色结果一致。

除了对细胞增殖的影响，生物材料的细胞相容性还表现在材料对细胞重要功能的影响。AKP是骨形成所必需的酶，是生物矿化和成骨细胞分化成熟的早期标志物[9-10]：其表达代表骨形成状况，表明细胞分化的开始，并随细胞分化的发展而增强；其活性的高低，反映了相应细胞向成骨方向化的趋势。本研究采用酶联法对成骨细胞AKP的表达进行检测，结果显示试验组AKP的表达量与对照组相比较差异无统计学意义，说明nHA-PEA复合材料对成骨细胞的功能酶表达无不良影响，也没有明显的促进作用，不抑制其分化功能。

用浸提液作为试验样品测定复合材料中滤出物质对细胞生长、增殖的影响，仅为预测材料植入体内的潜在危害提供了初步依据，其结果尚有一定的局限性；因此，需在浸渍试验良性结果的基础上再采用直接法将成骨细胞与材料联合培养，以进一步考察材料本体的结构性能对细胞生物学的影响。本研究表明，成骨细胞在复合材料上具有良好的黏附、铺展和增殖行为，即nHA-PEA复合材料具有成骨细胞相容性和良好的细胞相容性等特性。

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篇5

目的： 研究不同粒径磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。方法： 采用共沉淀法制备得到不同粒径FeOx，将不同粒径FeOx吸附于细胞表面，并加载静磁场(SMF)及100 Hz交变磁场(EMF)照射。运用CCK8检测纳米粒子吸附后在外加磁场作用下Bel7402细胞增殖情况，运用流式细胞仪检测细胞凋亡、死亡率及细胞周期变化。结果： 不同粒径磁性纳米FeOx在SMF照射时间低于72 h时能使Bel7402细胞增殖速度增快，当照射时间大于72 h时，细胞增殖速度未发生明显变化但部分细胞发生凋亡，凋亡率为(3.1±0.78)％。而经EMF照射后37 nm FeOx吸附细胞增殖被抑制，细胞周期实验结果表明大部分细胞被阻滞在G0/G1期，细胞出现大量死亡与凋亡，凋亡率达到(23.34±3.6)％、死亡率达到(57.24±2.7)％。结论： 纳米粒子未有外加磁场照射时不能对细胞产生明显的影响，外加SMF照射时，细胞的增殖及DNA代谢未发生明显的变化，但细胞发生凋亡；外加EMF照射时，细胞增殖被抑制并发生明显的凋亡及死亡，细胞DNA代谢明显紊乱，且具有较小粒径的磁性纳米FeOx在EMF作用下对肝癌细胞影响最为显著。

【关键词】 磁性纳米FeOx； 增殖； 凋亡； DNA周期

［Abstract］Objective: To study the effects of different diameters of nano FeOx powders on proliferation and DNA metabolism of heptomacell lines Bel7402.Methods： Different diameters of nano FeOx powders were utilized to dope the heptomacell lines Bel7402 through the coprecipitation meanings， then cells were exposed by static magnetic field(SMF) and extremely low frequency altering magnetic field(EMF) with 100 Hz. After exposed by external fields， CCK8 kit was used to detect the effects on proliferation of cells caused by nano powders. Apoptosis kit and DNA cycle kit was used to detect the effects caused by nano FeOx of cell apoptosis， death and cell DNA cycle metabolism. Results： Different diameters nano FeOx could not influence the cell at all under SMF exposure but could influence the cells under EMF， when the diameter was 37 nm the highest apoptosis and death ration were (23.34±3.6)％ and (57.24±2.7)%， respectively， and the most of cells were prohibited in G0/G1 period of DNA cycle. Conclusion： nano powders could not influence the cells at all without external magnetic field exposure. Under SMF exposure the proliferation and DNA metabolism of cells absorbing by nano powders were not influenced， but the apoptosis ratio of cells was increased. After exposure by EMF cells absorbing by nano powders could be affected in proliferation， apoptosis and DNA metabolism，furthermore， all the effects were more obvious in the cells absorbing by nano powders with little diameter under EMF exposure.

［Key words］magnetic nano FeOx； proliferation； apoptosis； DNA cycle

磁性纳米材料具有良好的磁导向性、较好的生物相容性、生物降解性和活性能基团等特点［1-3］，它可结合各种功能分子，如酶、抗体、细胞、DNA或RNA等，因而在靶向药物、控制释放、酶的固定化、免疫测定、DNA和细胞的分离与分类等领域可望有广泛的应用。磁性纳米材料特别是Fe属纳米颗粒已经被广泛应用于药物靶向治疗及干细胞定向移植治疗中［4］。当粒径在30～200 nm之间时，矫顽力和饱和磁化强度均达到最大值，且具有单畴特性。目前已有纳米磁性氧化铁等颗粒作为药物或干细胞载体用于肝癌动物实验的研究，但对磁性纳米氧化铁粒子本体对人体研究相对较少［5］。本研究以肝癌细胞Bel7402为对象，观察不同粒径磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对其生物学特性的影响，旨在为FeOx用于治疗肝癌提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器

肝癌细胞株Bel7402购自中国科学院上海细胞库。静磁场发生仪为两块强磁场稀有金属镍/铁永磁体，当两块磁体间距为2.5 cm时其场强为0.7特斯拉（T）。TYU2002H II型特斯拉计/高斯计为上海亨通磁电科技有限公司产品。变频仪(FT1000型)为南京万臣电子有限公司产品，变压器(PT800型)为上海富济电子公司产品。胰蛋白酶、Primilar1640培养基、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，维生素C、青霉素、链霉素为杭州四季青公司产品。CCK8试剂盒为美国ADL公司产品，细胞凋亡及周期试剂盒均购自美国BD公司。FeSO4、醋酸锌均为分析纯，购自南京化学试剂有限公司。扫描电镜(SEM)型号为HITACHIX650，X射线衍射仪(XRD)型号为Philips X′pert XRD system型。

1.2 方法

1.2.1 磁性纳米FeOx的制备

运用共沉淀法［5］以FeSO4及醋酸锌为反应物，反应在乙醇、水（1∶3）混合溶剂中进行并加入质量百分比为2％的甘油，制备得到醋酸亚铁前驱体，前驱体粉末灼烧温度为400℃，灼烧4 h后得到FeOx粉体，10 000 r/min离心30 min，得到上下两层不同粒径粉末，经SEM及XRD实验确定其粒径及成分组成。SEM实验前样品用超声清洗仪超声分散10 min。XRD实验条件为：扫描速率为2θ/min，测定纳米粉体XRD谱。

1.2.2 磁性纳米FeOx吸附细胞实验

将不同粒径纳米FeOx加入到细胞培养瓶中与细胞共同培养。纳米粒子吸附细胞方法为：将细胞消化成细胞悬液并调整细胞浓度大于105个/ml，再将不同粒径纳米粒子加入到细胞悬液中并在恒温摇床中匀速振荡30 min，摇床摇速为200 r/min。振荡完成后将细胞置于细胞培养箱中培养。细胞培养2 d后经SEM实验确定磁性纳米FeOx结合效率。

1.2.3 细胞培养

细胞种植到含10％FBS PIMIRIER 1640培养基的培养瓶，放置在37℃，5％CO2培养箱持续培养。细胞传代时用胰蛋白酶消化细胞成细胞悬液，磷酸盐缓冲液（PBS）1 500 r/min 15 min离心洗涤2次，用含10％FBS 1640培养基重悬细胞后种植细胞，每次细胞种植浓度应大于105个/ml。细胞临时保存在-70℃超低温冰箱，永久保存在液氮罐中，细胞冻存液配比为DMEM∶FBS∶DMSO=7∶2∶1(体积比)，细胞冻存浓度应高于106个/ml。

1.2.4 磁场照射细胞方法

静磁场(SMF)照射细胞方法为：将细胞培养瓶置于两块永磁体之中，同时置于细胞培养箱中培养，每间隔12 h照射1次，每次照射30 min，直至84 h。100 Hz交变磁场(EMF)照射细胞方法为：将细胞培养瓶置于离工作线圈顶端2 cm，经特斯拉计测量磁感应强度为0.67 mT，每间隔4 h照射1次，每次照射30 min，直至40 h。照射完成后，细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液进行各种检测。

1.2.5 CCK8细胞增殖实验

按试剂盒提供实验方法进行。首先取出96孔酶标板，依照次序对应分别加入50 μl的标准品于酶标板微孔中，分别标记样品编号，将50 μl细胞培养悬液（2.5×104个/ml）加入到酶标板中；在标准孔和样品孔中加入100 μl的酶标记液，36℃孵育1 h，将溶液倾出， PBS清洗5次后每孔加入底物A，B液各50 μl，36℃下避光孵育反应15 min后加入终止液50 μl，终止反应。测定450 nm的光密度值。每隔12 h重复进行以上步骤，72 h得到细胞增殖数据绘制细胞增殖曲线。

1.2.6 细胞凋亡、死亡及周期实验

细胞凋亡及周期实验均在流式细胞仪上完成，均按试剂盒提供实验方法进行。凋亡实验方法为：将细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液，并用PBS洗涤2次并将细胞浓度重悬调整为106个/ml。染色过程为首先用微量移液枪移取20 μl细胞悬液，然后用AnnexinV加入到细胞悬液中并避光静置15 min后将PI染料加入并静置30 min，染色完成后上机实验。细胞周期实验方法为：首先按凋亡实验相同方法处理细胞以待上机检测，染色方法为将试剂盒内A，B，C，D 4种试剂按顺序分别加入到细胞悬液中，避光静置时间均为15 min。染色完成后上机实验。流式细胞仪实验条件为：细胞进样流速中速，前向角补偿电势为56 V。

1.2.7 统计分析

实验结果用±s表示，使用SPSS13.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 纳米FeOx表征实验结果

SEM及XRD实验结果表明两种粒子的平均粒径分别为37，70 nm左右，粒子形状为不规则球形（图1，2）。根据Scherrer 公式：D=Kλ/βcosθ，其中D为粒子粒径，K为形状因子，λ为X 衍射的波长，β为衍射峰的半峰宽，θ为衍射角。经XRD实验结果证明粒子中Fe，O两种元素的比例为1∶1.12。图3为2种FeOx与Bel7402细胞吸附情况，图中FeOx为黑色颗粒，FeOx与Bel7402细胞发生了较为明显的吸附，37 nm粒子更易于在细胞表面吸附，表现为每个细胞表面吸附粒子数量明显增加。

(a)37 nmFeOx(×30 000倍）(b)70 nmFeOx(×10 000倍)

2.2 细胞增殖实验结果

不同粒径纳米FeOx在未经磁场照射时并未对细胞增殖产生明显的影响，细胞经SMF照射其增殖在磁场照射初期速度变快，当照射时间超过72 h后增殖未发生明显改变(相对对照组)。 经EMF照射后两种粒子吸附细胞的增殖均被抑制，当EMF照射时间为5 h时细胞增殖抑制率达到最大，37nm FeOx抑制率达到（76.31±2.3）％，70 nm FeOx抑制率为（53.56±5.2）％。

2.3 细胞凋亡及死亡实验结果

从表1可见，凋亡率、死亡率3组间比较差异无统计学意义，说明未经磁场照射的纳米粒子不能导致细胞死亡及凋亡。表2可见37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经SMF照射达到60 h后，细胞发生凋亡，当照射时间为72 h时37 nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（3.13±0.78）％，70 nm FeOx吸附细胞的凋亡率仅为（1.25±0.23）％。而未经磁场照射37nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（0.01±0.03）％，70 nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（0.02±0.04）％，未经FeOx吸附细胞的凋亡率为（0.01±0.02）％。表1 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞自然生长凋亡率及死亡率，Tab 1 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx（略）；表2 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经SMF照射细胞凋亡率及死亡率，Tab 2 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by SMF（略）。

表3表明随着EMF照射时间的延长，细胞凋亡率随之增加，当照射时间达到5 h时其凋亡率最大，37 nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（23.34±3.6）％，死亡率（57.24±2.7）％。而70 nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（12.54±6.7）％，死亡率为（37.28±4.2）％。当照射时间超过5 h后，细胞凋亡率增速变慢。表3 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经EMF照射凋亡率及死亡率，Tab 3 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by EMF（略）

2.4 细胞周期实验结果

从表4可见，37 nm和70 nm FeOx吸附细胞自然生长细胞周期，与未经处理Bel7402细胞作比较，无统计学意义，与凋亡实验结果相符，表明FeOx吸附细胞并不能影响细胞周期代谢。表5表明当细胞被纳米粒子吸附并在外加SMF照射下细胞DNA代谢未发生紊乱，在SMF照射初期细胞处于S，G1期细胞比例增加，细胞增殖变快，与细胞增殖实验结果吻合，当照射时间超过72 h后细胞处于G0期含量增加，细胞进入增殖静止期。凋亡实验结果表明此时细胞发生明显的凋亡，表明细胞凋亡通路被激活，细胞增殖可能被抑制。表4 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞自然增殖细胞周期实验结果，Tab 4 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx（略）；表5 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经SMF照射细胞周期实验结果，Tab 5 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by SMF（略）。

表6表明，37 nm和70 nm FeOx吸附细胞在外加EMF作用下，细胞DNA代谢均发生明显变化，细胞周期中G0/G1值增加， 照射5 h时37 nm粒子吸附细胞值为（91.6±1.3）％，而70 nm粒子吸附细胞值为（63.5±2.4）％，细胞增殖被抑制。表6 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经EMF照射细胞周期实验结果，Tab 6 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by EMF（略）。

3 讨论

磁性纳米材料已经被用作药物或干细胞的载体用于各种疾病的靶向治疗［6］，但现有研究多集中于纳米粒子与药物或干细胞的吸附研究，对磁性纳米粒子本体在外加磁场作用下对细胞或生物体影响的研究较少，本研究即以磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对肝癌细胞Bel7402的影响为研究对象。

我们采用共沉淀法制备得到的纳米FeOx粒子的平均粒径分别为37 nm及70 nm且粒径分布均匀。粒子形状为不规则球形，XRD实验结果表明粒子的表面有较多的空间位隙，导致粒子中两种元素的化学计量比不规则，其Fe与O计量比为1∶1.12。已有研究表明具有晶格缺陷的纳米粒子更容易吸附小分子物质或更容易吸附在其他物质表面［7］，本文合成得到的纳米粒子具有较多的晶格缺陷，实验用纳米FeOx较易在细胞表面发生吸附。

细胞增殖实验表明，37 nm和70 nm FeOx吸附在细胞表面后在SMF照射条件下，细胞增殖速度在照射初始阶段增加，当照射时间超过72 h后细胞发生凋亡，但增殖速度未发现明显变化，可能由于FeOx吸附细胞后在SMF照射条件下更易沉降到细胞培养瓶底部。纳米FeOx并不能影响细胞的正常分裂与增殖，同时SMF照射细胞也不能引起细胞发生改变，与文献报道结果类似［8］。EMF照射细胞能抑制细胞增殖，细胞增殖时间明显延长，当EMF照射时间达到5 h后，EMF照射FeOx吸附细胞抑制达到最大。比较两种FeOx吸附细胞在EMF照射条件下细胞增殖结果可以得出，37 nm FeOx粒子对细胞的增殖抑制更为显著，表明纳米FeOx在EMF照射下能很好地抑制肝癌细胞的增殖。

EMF照射细胞本身能影响细胞的增殖，导致细胞早期凋亡以及细胞DNA代谢发生紊乱和DNA双链断裂［9］。本研究表明，纳米粒子吸附到细胞表面后在外加EMF作用条件下这种影响更为明显，具有更小粒径的FeOx在EMF作用下对细胞凋亡的影响更为显著。同时，随着EMF照射时间增加，FeOx吸附的细胞DNA代谢发生紊乱，大部分细胞被阻滞在G0/G1期，同时处于S期的细胞含量减少，表现为明显的S期和G2 期阻滞。

纳米粒子在吸附到细胞表面后可一定限度地改变细胞表面电势，EMF同样能改变细胞表面的电势而导致细胞发生凋亡等生理现象［9，10］。两种外加因素对细胞的影响有明显的叠加效果，纳米FeOx在外加EMF作用下发生明显的振荡现象能较大程度改变细胞膜表面的电势分布，从而改变Na+，K+，Ca2+等离子通过细胞膜表面的速度和方向，Ca2+代谢与细胞的凋亡相关，Na+，K+与细胞死亡和DNA代谢相关［10］。同时，纳米FeOx在磁场作用下发生振荡能导致明显的热效应［11］，导致细胞发生凋亡或死亡以及导致细胞DNA发生明显的代谢紊乱。37 nm FeOx在外加EMF作用下对Bel7402的影响更为明显，在EMF作用下振荡更为剧烈［12］。

综上所述，不同粒径磁性纳米FeOx吸附在细胞表面并不能影响细胞的增殖，也不能导致细胞发生凋亡或DNA代谢紊乱；在SMF照射时，在磁场照射初期能提高吸附有纳米粒子的细胞增殖速率，当照射时间达到72 h时能导致细胞发生凋亡；在EMF照射时，吸附有纳米FeOx细胞的凋亡及死亡率急剧变大，表明磁性纳米粒子与EMF对细胞的作用有叠加效果，具有较小粒径的纳米FeOx在EMF作用下对细胞的影响更为剧烈。磁性纳米FeOx在外加EMF作用下能很好地抑制细胞的增殖。对纳米粒子在细胞表面的吸附率、与细胞的融合以及对细胞膜表面电势的影响及热效应还需进行更为深入的研究。

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篇6

【Abstract】 AIM: To observe the effects of the demethylating agent， 5Aza2′deoxyctidine (5AzaCdR)， on the proliferation， cell cycle， apoptosis and xaf1 mRNA expression of stomach cancer BGC823 cells. METHODS: The proliferation of BGC823 cells treated by different concentrations of 5AzaCdR was detected by MTT assay. Assessment of cell cycle and apoptosis were performed by flow cytometry (FCM); the change of xaf1 mRNA expression was semiquantified by RTPCR before and after 5AzaCdR treatment. RESULTS: The growth inhibitory effects on BGC823 cells were observed in a dosedependent manner after exposure to 5AzaCdR at different concentrations (1×103， 5×103， 10×103 nmol/L) for different time. FCM analysis showed that the apoptosis rates in BGC823 cells ［(4.53±0.21)%， (8.11±1.01)%， (11.56±0.86)%］ increased significantly after exposure to 5AzaCdR for 72 h as compared with the control group ［(0.51±0.01)%， P

【Keywords】 5AzaCdR；xaf1；BGC823；methylation；proliferation；apoptosis

0 引言

凋亡抑制蛋白因子家族(IAP)的成员在结构上具有1至3个高度保守的杆状病毒凋亡抑制因子重复序列(BIR)结构域［1］，在肿瘤的增殖异常及对抗肿瘤药物耐受形成中发挥了重要作用. X染色体相关凋亡抑制蛋白(XIAP)是IAP中抑制Caspase活性最强的成员. XIAP相关因子1(XAF1)是一个新近发现可以拮抗XIAP抗凋亡作用的蛋白，它可以逆转XIAP对细胞的保护. XAF1在多种肿瘤细胞和组织中存在低表达或表达缺失，XAF1的基因沉默与其启动子高甲基化明显相关［2］. 我们采用5AzaCdR对胃癌细胞株进行处理， 检测xaf1基因表达，并分析肿瘤细胞生物学行为变化，以期进一步探讨胃癌的发生机制及治疗的新方法.

1 材料和方法

1.1 材料 胃癌BGC823细胞株（兰州大学病理解剖学教研室）；RPMI1640培养液（美国Gibco公司）；胎牛血清（兰州民海生物技术有限公司）；5AzaCdR（美国Sigma公司）；配制5AzaCdR为1 mol/L的母液，-20℃保存，使用时用RPMI1640稀释为工作浓度. Tap酶（上海生工生物工程技术有限公司）；酶联免疫检测仪(BioTek公司)；Trizol(Invitrogen公司)；UV3000紫外分光光度仪（上海美谱达公司）；流式细胞仪(Beckman Coulter公司).

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞贴壁生长于RPMI1640培养液中，内含100 mL/L胎牛血清、1×105/L青霉素、100 mg／L链霉素和2 mmol/L L谷氨酰胺，置于37℃ 50 mL/L CO2的饱和湿度箱中培养，每3～4 d消化传代1次. 传代时，常规消化BGC823细胞，置于75 mm培养瓶中，培养24 h后分别用含1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR的完全培养液连续培养24，48和72 h后弃去药液，用完全培养液继续培养24 h后进行实验. 以同体积磷酸盐缓冲液PBS(pH 7.4)处理的细胞作为对照组. 培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态的变化.

1.2.2 MTT法绘制细胞生长曲线 取对数生长期细胞，常规消化后按每孔2×103个(100 μL)接种于6块96孔培养板中，过夜贴壁后弃完全培养液，分别加入含1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR药液的完全培养液，每孔100 μL，每组设3个复孔；对照组加入等量PBS. 每日取出1板加入5 g/L MTT液10 μL，37℃孵育4 h后加DMSO 150 μL，振荡器振荡10 min充分溶解结晶，在酶联免疫检测仪测定各孔A470 nm值，求其平均值，以A470 nm值为纵坐标，时间(d)为横坐标绘制生长曲线，计算细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，CPIR). CPIR(％)=(1-实验组A470 nm均值／对照组A470 nm均值)×100％.

1.2.3 RTPCR检测xaf1基因mRNA表达 取对数生长期BGC823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集细胞，Trizol一步反向法抽提细胞总RNA，在紫外分光光度仪上测定吸光度值，鉴定RNA纯度，A260 nm／A280 nm在1.8～2.0之间. PCR引物设计及反应条件如下：xaf1：预期产物片段大小为120 bp，退火温度：56℃；Sense：5′TGGGTGTAGGATTCTCCAGG3′，Antisense：5′GGTTTGCCCAAGGACTACAA3′. 内参照GAPDH:预期产物片段大小为456 bp，退火温度：52℃；Sense：5′TTCTCCCCATTCCGTCTTCC3′，Antisense：5′GTACATGGTATTCACCACCC3′，上述引物由大连宝生物有限公司提供合成. 两步法RTPCR：① 逆转录反应：20 μL反应体系含：2 μg模板RNA，0.5 g/L Oligo(dT)18，RNasefree ddH2O，5×Reaction Buffer，2×107 U/L RNase Inhibitor，10 mmol/L dNTP Mix，2×107 U/L AMuLV RT. 70℃ 5 min，37℃ 5 min，37℃ 60 min，70℃ 10 min，4℃保存. ② 聚合酶链反应：50 μL反应体系含：cDNA 1 μL，10×buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L dNTP 5μL，Tap酶0.5 μL，上下游引物各1 μL，去离子水补至50 μL，GAPDH作内参照. PCR仪扩增条件：94℃变性4 min，按94℃ 30 s，52℃（或54℃）40 s，72℃ 45 s，进行35个循环，最后一个循环72℃延伸5 min. PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统分析，以xaf1和GAPDH吸光度比值相对定量.

1.2.4 细胞周期和凋亡率检测 取对数生长期BGC823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集培养细胞，PBS洗2次，调整细胞密度为1×109个／L，700 mL/L冷乙醇－20℃固定24 h，加RNaseA至终浓度1 g/L，37℃温育30 min，加碘化丙啶至终浓度50 g／L，1 h内测定. 以流式细胞仪进行细胞周期分析和凋亡率的检测.

统计学处理:实验数据以x±s表示，采用SPSS 11.5软件进行分析，不同组间率的比较采用单因素方差分析.

2 结果

2.1 5AzaCdR对细胞增殖的影响 分别用1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR处理6 d后，BGC823细胞的生长增殖活性均有明显抑制，3个试验组的CPIR值分别为（22.36±0.68）%，（32.12±1.27）%和（41.34±1.62）%，与对照组相比差异显著（P

bP

图1 BGC823细胞经5AzaCdR处理前后的生长曲线（略）

2.2 5AzaCdR对细胞中xaf1基因mRNA表达的影响 5AzaCdR处理前BGC823细胞系的xaf1基因mRNA不表达，在经5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR处理后，xaf1基因mRNA重新表达，10×103 nmol/L的5AzaCdR处理组尤为明显，在用药48，72 h后，该基因表达呈明显上升的趋势(图2，3).

2.3 5AzaCdR对细胞周期的影响 BGC823细胞经1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR处理72 h后，S期的细胞数量逐渐增加，G2/M期细胞数下降，凋亡率明显增加 (表1).

M：50 bp DNA Ladder maker D512A；1：对照组；2～4：5×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h；5～7：10×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h.

图2 BGC823细胞经5AzaCdR处理前后GAPDH mRNA的表达（略）

M：50 bp DNA Ladder maker D512A；1：对照组；2～4：5×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.22，0.32，0.37)；5～7：10×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.90，0.98，1.31).

图3 BGC823细胞经5AzaCdR处理前后xaf1 mRNA的表达（略）

表1 BGC823细胞经5AzaCdR处理72 h后细胞周期的变化（略）

aP＜0.05， bP＜0.01 vs对照.

3 讨论

DNA甲基化是由S腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，在细胞内甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化作用下，在胞嘧啶(C)的第五位碳原子上加上甲基基团，变成5甲基胞嘧啶(5mC)的化学修饰过程［3］. 近期研究表明，多种人类肿瘤在发展过程中表现异常DNA甲基化模式，常见为甲基化酶水平提高、整个基因组范围甲基化减弱以及局部甲基化水平增高3种，以局部甲基化水平增强较多见［4］. xaf1基因定位于染色体17p13.2位点，研究表明，xaf1基因在多种肿瘤细胞株以及肝癌［5］、结肠癌［6］、黑色素细胞瘤［7］组织中表达降低，存在转录抑制现象，现已证明xaf1基因表达沉默与5′区域CpG岛异常高甲基化相关，转录过程中调控区域的CpG岛高甲基化导致xaf1基因表遗传修饰而失活. 我们采用不同浓度(5×103，10×103 nmol/L)的特异性DNMT抑制剂5AzaCdR，对体外培养的胃癌BGC823细胞进行干预，RTPCR结果显示在5AzaCdR作用前，xaf1 mRNA不表达，而在5AzaCdR作用后，xaf1 mRNA又重新表达，表达强度呈时间和剂量依赖关系，表明DNA甲基化与基因遗传学改变不同，基因的缺失、突变等遗传学改变是不可逆的，而甲基化的DNA核苷酸序列未发生改变，仅通过个别碱基的修饰来影响基因转录，因而是可逆的［8］. 因此我们通过5AzaCdR人为的干预拮抗表遗传学改变，诱导因表遗传学改变而失活的xaf1基因表达，为去甲基化治疗肿瘤提供了理论基础.

凋亡在细胞增殖、肿瘤形成和发展中也起调控作用［9］. 我们应用不同浓度(1×103，5×103，10×103 nmol/L)5AzaCdR诱导胃癌BGC823细胞后，MTT结果显示：细胞增殖受到明显抑制；流式细胞仪细胞周期分析可见S期的细胞数逐渐增加，G2/M期细胞数下降，同时细胞凋亡率明显增加呈时间和浓度依赖关系. 这一结果显示去甲基化后能使细胞阻滞于S期，而使得进入G2/M期的细胞减少，由此推断5AzaCdR的去甲基化作用可通过影响细胞周期而抑制胃癌细胞的增殖；同时xaf1基因去甲基化后重新表达，它可直接结合并抑制XIAP对caspase活性的抑制作用从而发挥诱导凋亡作用［2］，xaf1也是一种新的干扰素(IFN)诱导基因，其介导了IFN诱导凋亡的作用，并显著增强了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导肿瘤细胞凋亡的作用［10］.

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inhibitory effects of  5f from pteris semiinnata  l. on proliferation of nonsmall cell lung cancer ncih460 cells

    liu yi1，wu kefeng1，li li1，george g chen2，michael ky hsin2，malcolm j underwood2，liang lianci1，3

    1. guangdong key laboratory for research and development of nature drugs，guangdong medical college， zhanjiang 524023，china；2. department of surgery，the chinese university of   hongkong，prince of wales hospital，shatin，n.t.；3.institute of biochemistry and molecular biology，guangdong medical college

    corresponding authors：liang lianci，email：plliu78@sina.comabstract：objective   to investigate inhibitory effects of 5f from pteris semiinnata l. on proliferation of nonsmall cell lung cancer ncih460 cells. methods  ncih460 cell growth inhibition mediated by 5f was detected by mtt. pihoechst double staining and tunel assay  were used to observe cell  apoptosis. flow cytometer was used to determine the effect of 5f on the content of dna in cells. results  5f displayed growth inhibitory activity against ncih460 cells with ic50 values of  21.40,4.52 and 1.02 μg/ml   at the  point  of   24, 48 and 72 hours. 5f could induce apoptosis. ncih460 cells treated by 5f were arrestet   in g2/m. conclusion  in vitro 5f  significantly   inhibited  the proliferation of ncih460 cells and the activity might   be realized through   inducing apoptosis.

    key words：pteris semiinnata l;  5f;  ncih460;  proliferation inhibited

半边旗（pteris semiinnata l.）是生长在我国南方的传统中草药，民间用其来治疗感染性疾病。从半边旗中分离提取到一些具有生物活性的物质，以5f含量最高，其结构为二萜类化合物，见图1。化学结构名为11α羟基15氧16烯对映贝壳杉烷19酸（ent11αhydroxy15oxokaur 16en19oic acid）。本课题研究表明5f在体外能抑制多种癌细胞的生长并诱导凋亡的发生；能明显减小k562、s180等瘤株在小鼠所形成的肿瘤大小，延长小鼠存活时间[13]。

    肺癌是目前全世界人类最主要的癌症死因之一，其中75%～80%为非小细胞肺癌（nsnlc）， 晚期肺癌患者仅有2%存活率超过5年，通常不满1年。近年来，对肺癌患者的治疗还是以化疗和放疗为主导，这些治疗药物和措施会给患者带来极大的痛苦，因此，从天然植物中提取具有抑制肺癌细胞生长的高效低毒的化合物已经成为抗肿瘤研究的热点。本研究旨在探讨5f对非小细胞肺癌ncih460细胞生长的抑制作用及可能的机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    从植物半边旗中提取的5f，纯度为100%，使用前溶于dmso。

    mtt、hoechst33342、pi为sigma公司产品；超级无支原体新生牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司；rpmi1640购自美国hyclone公司；胰酶购自美国gibco公司；细胞凋亡检测试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品；其余试剂均为国产分析纯。

    非小细胞肺癌nci－h460细胞由本室传代。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养

    ncih460细胞培养于含10%小牛血清，100ku/l青霉素和100mg/l链霉素的rpmi1640培养液中，37℃、5%  co2饱和湿度细胞培养箱培养。取对数生长期细胞用于实验。

    1.2.2  mtt法检测5f对ncih460细胞的生长抑制作用

    取对数生长期的ncih460细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，rpmi1640完全培养液调制成2.0×104/ml细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种100μl（含2.0×103个细胞）。培养过夜后，吸出培养液，加入新培养液90μl及不同浓度的5f药液10μl，使终浓度分别为5、10、20、40、80μg/ml。同时设置adm阳性对照组，空白对照组加入相同体积的培养液，每一浓度设8个平行孔。继续培养24、48、72h。每孔加入mtt(5g/l)20μl，继续培养4～6h。每孔加入dmso 100μl。在微型振荡器上摇匀15min，结晶溶解后，立即比色，用elx800型酶标仪在主波长为570nm，参比波长为630处测量od值，比色以空白孔调零。实验重复3次。

    抑制率=（1-实验组8孔od值平均值/对照组8孔od值平均值）×100%。

    bliss方法计算半数抑制浓度ic50。

    1.2.3  荧光显微镜观察细胞形态

    取对数生长期细胞， 调整细胞浓度为2.0×105/ml， 加1ml到预先放置盖玻片的6孔板中， 24h待细胞爬片后， 加入不同浓度的5f药液， 使其终浓度为5、 10、 20μg/ml， 继续培养24h后， 用预冷的pbs洗涤2次， 加入hoechst33342  37℃染色15min， pbs洗涤2次， 再加入pi染色液于冰上染色15min,  pbs洗涤2次,于荧光显微镜下观察并拍照。

    1.2.4  流式细胞仪检测dna含量的变化

    参照文献介绍的方法略加改进，1 000r/min, 离心5min收集药物处理组和对照组细胞，pbs洗涤2次，体积分数为70%的乙醇-20℃固定24h以上，pbs离心洗去乙醇后加pi染液(含50mg/l  pi，10mg/l  rnasea，0.1% tritonx100,  0.1%柠檬酸钠和0.5%nacl),室温下避光染色30min，400目筛网过滤,用epicsxl型(美国)流式细胞仪检测dna含量，实验重复3次。

    1.2.5  细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡

    取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2.0×105个/ml，加1ml到预先放置盖玻片的6孔板中，24h待细胞爬片后，加入不同浓度的5f药液，使其终浓度为5、10、20μg/ml，继续培养24h后，用4%多聚甲醛／0.01m pbs室温下固定60min，余下步骤按试剂盒说明书进行操作。

    2  结果

    2.1  5f对ncih460细胞生长的抑制作用

    从表1和图2的结果可以看出，5f能明显抑制ncih460细胞的生长，其效果与时间和浓度相关。5、10、20、40、80μg/ml的5f在作用细胞48h后效果与阳性对照药adm相近。5f作用ncih460细胞24、48、72h的ic50分别为：21.40、4.52、1.02μg/ml。

    2.2  荧光显微镜观察5f对ncih460细胞的影响

    经pihoechst双染的ncih460细胞， 对照组细胞核大小较均一， 呈圆形或椭圆形， 染色质分布均匀， 此外光下显蓝色荧光， 出现个别坏死细胞， 见图3a。 而经5f处理24h后的ncih460细胞细胞形态则出现不同程度皱缩， 变形， 染色质浓缩， 部分细胞核染色体碎裂， 并有凋亡小体出现， 见图3b～d。 且细胞凋亡形态出现的多少与5f的浓度相关。

    2.3  流式细胞仪检测细胞dna的变化

    5f作用细胞24、48h后ncih460细胞的dna含量发生变化。随着5f作用终浓度的增加（5～40μg/ml），g0/g1期dna出现含量降低，s期表1  5f对ncih460细胞的生长抑制作用表2  5f处理ncih460细胞不同时相dna含量的影响变化不明显，g2/m显著增加。提示5f可以将ncih460细胞阻滞在g2/m期，见表2。

    2.4  tunel法检测5f对ncih460细胞凋亡的影响

    tunel法检测显示正常对照细胞不显深棕黄色,而经5f处理后的细胞胞核呈深棕黄色，表现为形态皱缩,核固缩,凝集成块，并形成凋亡小体，其凋亡数与5f剂量呈正相关，见图4。

    3  讨论

    临床上用于治疗肿瘤的热疗、放疗、化疗及生物疗法一直被用于杀死肿瘤细胞，随着肿瘤的治疗正朝着日益完善的综合治疗方向迈进，尤其近十几年迅速发展的生物治疗给人们带来了新的希望，但目前化学药物治疗在临床上依然起着重要作用。由于化疗药物的毒副作用及易产生耐药性等缺陷，从天然产物中筛选新的高效低毒的抗肿瘤药仍然是当务之急。本课题对半边旗的有效活性成分及提取工艺进行了详细的研究[46]，多年的实验证实其二萜类提取物5f 在体外可致人的多种癌细胞死亡，主要作用机制是诱导肿瘤细胞凋亡并能抑制肿瘤细胞的迁移[79]。

    细胞凋亡(apoptosis)是细胞在其生长、发育过程中发生的一种复杂的生理和病理过程，对机体的正常发育和自身稳定起着极其重要的作用。凋亡细胞的特征是细胞体积缩小，随即与邻近细胞的连接丧失，彼此脱离，失去微绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质浓缩呈块、团，典型的为半月形，凝聚于核膜周边，核仁裂解，进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个具有完整膜性结构，内含各种细胞成分的凋亡小体。不少疾病(包括肿瘤)的发病与凋亡受抑制有关，许多抗癌药物都是通过最终触发肿瘤细胞凋亡通路达到治疗的目的[6]。大多数抗癌药物都可引起肿瘤细胞的凋亡，诱导细胞凋亡可能是抗癌药物发挥作用的共同通路，所以细胞凋亡成为评估抗癌药物作用能力的一项重要指标。

    细胞的生长增殖，24、48、72h的ic50分别为：21.40、4.52、1.02μg/ml，5f对其的生长抑制作用呈浓度－剂量及时间－剂量关系；荧光双染的结果显示经不同浓度的5f处理24h后的ncih460细胞细胞形态出现不同程度皱缩，变形，染色质浓缩，部分细胞核染色体碎裂，并伴有凋亡小体出现，细胞凋亡形态出现的数量与5f的作用浓度有关,这提示5f体外对ncih460的生长抑制作用可能与其诱导凋亡有关；流式细胞仪检测结果发现细胞被阻滞在g2/m期，但5f终浓度为40μg/ml时，细胞周期各时相均出现不同程度的改变，这可能与高浓度5f直接杀伤细胞，表现出细胞毒作用有关；进一步用tunel法进行凋亡检测证实了5f抑制ncih460生长的作用是由其诱导凋亡而产生的。提示5f具有诱导ncih460细胞凋亡的能力，是一种值得深入研究的新型抗肿瘤候选化合物。

【参考文献】

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［4］ 吕应年，吴科锋，邓亦峰，等.高效液相色谱法测定半边旗中木犀草素的含量[j]. 时珍国医国药，2007，18（1）：102103.

［5］ 典灵辉，梁念慈. 半边旗药材提取工艺的研究[j]. 中国药业，2007，16（9）：2425.

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［7］ 何太平，覃燕梅，莫丽儿，等. 半边旗二枯类化合物sf对高转移卵巢癌ho 8910pm细胞中癌相关基因表达的影响[j]. 中国药理学通报，2008， 24（1）：117122.

篇8

目的探讨夜香树不同提取物对小鼠白血病细胞株L1210细胞的增殖抑制作用及机制。方法采用四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法、平板集落法和Hoechst33258荧光染色法观察夜香树提取物对L1210细胞的生长抑制和凋亡的影响。结果夜香树提取物中正丁醇提取物和多糖提取物对L1210细胞有浓度依赖性的细胞毒性作用，在终浓度为62.5 μg·ml-1范围，其正丁醇提取物和多糖提取物对L1210细胞的抑制率大于90%，IC50均小于10 μg·ml-1，夜香树正丁醇和多糖提取物能抑制L1210细胞集落形成，并可诱导L1210细胞发生凋亡。结论夜香树提取物对小鼠白血病细胞株L1210细胞的增殖抑制可能通过诱导L1210细胞发生凋亡而发挥作用。

【关键词】 夜香树提取物； 小鼠白血病细胞； 细胞增殖； 集落形成

Abstract：ObjectiveTo evaluate the inhibitory effect of different extracts from Cestrum nocturnum Linn..(CN) on mouse leukcmic L1210 cells and explore its mechanism. MethodsThe MTT assay， colony forming experiment and Hoechst 33258 fluorescence measurement were used to analyze the effect of extracts from CN on leukcmic L1210 cells. ResultsThe n-bulty alcohol part and polysaccharide part extracted from CN had dose-dependent effects of cytotoxicity.When the concentration was 62.5 μg·ml-1， the inhibitory rate of cells growth was above 90% and the IC50 was below 10 μg·ml-1.The inhibitory rate of cells had remarkable dose-dependence. They both could inhibit colony information and induce apoptosis of L1210 cells. ConclusionThe inhibitory effect of extracts from CN.on leukemic L1210 cells prolifertion may be related with apoptosis.

Key words：Extracts from Cestrum nocturnum Linn.； Leukemic； Proliferation； Colony forming

夜香树，又名夜来香，茄科属植物Cestrum nocturnum Linn.，文献报道夜香树提取物有抗实验心率失常局部麻醉和中枢抑制作用［1，2］。课题组将夜香树（以下简称CN）叶及嫩枝用乙醇进行渗漉提取后，浸膏以系统溶剂分离进行部位分离，得到CN提取物，体外培养小鼠白血病L1210细胞，观察不同浓度的CN提取物对其抑制作用，初步探讨其抑制作用的机制。现报道如下。

1 材料和方法

1.1 药物 CN叶及嫩枝采自广西境内，经本院药用植物教研室刘寿养教授鉴定为茄科属植物夜香树Cestrum nocturnum Linn.。

1.2 受试药物的提取及配制CN叶及嫩枝经日晒干燥后，采用渗漉法得乙醇浸膏，浸膏用硅胶拌匀后，依次用石油醚，醋酸乙酯，水饱和正丁醇，然后用95%乙醇和50%乙醇等回流提取，回收溶剂，得CN石油醚部位、 CN醋酸乙酯部位、CN正丁醇部位、CN多糖部位。CN正丁醇部位和CN多糖部位分别用生理盐水注射液配制成5 mg·ml-1，G6漏斗滤过除菌，4℃冰箱内保存备用。

1.3 细胞培养 L1210细胞系小鼠淋巴细胞白血病细胞，购自上海细胞生物研究所细胞库。将L1210细胞接种于DAB/2小鼠腹腔内，传代保种。临用时处死小鼠抽取腹水，离心收集细胞，经洗涤后用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液进行培养，在含5%CO2的37℃温箱中培养，每3 d传代1次。

1.4 MTT比色法［3］检测CN提取物对小鼠白血病L1210细胞增殖的影响取对数生长期的L1210细胞用含10% FBS的RPMI 1640培养液配成1×104·ml-1，接种在96孔培养板中，每孔200 μl，每组设4个平行孔。置37℃，10%CO2培养箱中培养24 h后， 离心弃上清，实验组分别加入最终浓度为62.5，31.25，15.62，7.81，3.90 μg·ml-1的CN提取物的培养液，正丁醇部位以及多糖部位的对照组则加入等体积溶剂的培养液，而石油醚部和醋酸乙酯部另设DMSO空白对照，加入等体积含DMSO的培养液；置37℃，10% CO2培养箱培养3 d后弃去上清液，加入200 μl /孔新鲜配制的含0. 2 mg·ml-1 MTT的无血清培养液，37℃继续培养4 h，弃去上清液，加入200μl /孔 DMSO，振荡混匀后，在酶标仪上以波长为550 nm，参比波长为450 nm测定OD值，测定时减去空白对照。实验重复4次。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。

肿瘤细胞生长抑制率%=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值) ×100%。

1.5 集落形成实验 取对数生长期的L1210细胞，用培养液配成每1 000/ml的细胞悬液，实验组分别加入不同浓度的CN提取物 (62.5，31.25，15.62，7.81 μg·ml-1和3.90 μg·ml-1)，对照组加入等体积的溶剂。取已融化的5%琼脂液1份，加入到9份37℃含10%胎牛血清的培养液中，加入到平皿，每个1ml，置室温凝固。取预温细胞按每9.4 ml加5%琼脂0.6 ml混匀，加到已铺底层琼脂平皿中，每个1 ml。置10 % CO2，37℃条件下培养7 d。在倒置显微镜下计数含50个细胞以上的集落数，计算集落形成抑制率：集落形成抑制率（%）=(1-给药组集落数/对照组集落数)×100%。

1.6 Hoechst 33258染色法 将L1210细胞接种于10%胎牛血清的培养基中，加96孔培养板中，每孔200 μl。实验组分别加入不同浓度的CN提取物，对照组加入等体积溶剂。置10%CO2，37 ℃培养72 h后，每孔取100 μl细胞悬液，加2 mmol·L-1Hoechst 33258 1 μl，37℃染色15 min，取40 μl滴到干净的玻片上，加盖玻片，在荧光显微镜下观察(40×)，随机计数300个细胞，计算细胞凋亡率。实验重复3次。

1.7 统计学处理 实验数据用±s，数据统计分析采用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理，组间比较用t检验。

2 结果

2.1 CN提取物对小鼠白血病L1210细胞的毒性作用将浓度不同的CN提取物作用于体外培养的小鼠白血病L1210细胞72 h。结果见表1。

表1 CN不同提取物用MTT法对小鼠白血病L1210细胞的抑制作用（略）

*P＜0.05；**P＜0.01vs compared with the negative control group

从表1可以看出，醋酸乙酯部位对白血病细胞株L1210的抑制作用较弱，而石油醚部位对白血病细胞株L1210有一定的抑制作用，IC50为21.35 μg·ml-1，CN正丁醇部位、CN多糖部位对L1210细胞有很强的抑制率作用，IC50分别为6.97 μg·ml-1，5.85 μg·ml-1；阳性对照As2O3的IC50分别为13.40 μg·ml-1。

2.2 CN提取物对小鼠白血病L1210细胞集落形成的抑制作用 CN正丁醇部位及CN多糖部位不同浓度对L1210细胞集落形成，用As2O3 作阳性对照。结果见表2。

表2 CN提取物不同浓度对肿瘤细胞株集落形成的影响（略）

*P＜0.05；**P＜0.01vs compared with the negative control group；n=10

表2结果显示，CN正丁醇部位、多糖部位的3个实验剂量组对L1210细胞的集落形成均有不同程度的影响，各剂量组与阴性对照组均有显著的差异。

2.3 CN提取物对小鼠白血病L1210细胞凋亡的影响用不同浓度的CN正丁醇部位、CN多糖部位处理L1210细胞72 h，用Hoechst 33258染色后，在荧光显微镜下可见凋亡细胞，细胞强蓝色荧光，弱红色荧光，在终浓度为15.62 μg·ml-1，CN正丁醇部位、CN多糖部位、阳性对照组对L1210细胞凋亡率分别为（46.26±3. 80）%，（52.21±5.31）%，（56.12±3. 9）%， L1210细胞自然凋亡率为（10.36±1.7）%。在15.62 μg·ml-1范围，CN正丁醇部位、CN多糖部位对L1210细胞凋亡率与阴性对照组相比较有显著性差异（P

3 讨论

白血病是造血系统的恶性肿瘤，占癌肿总发病率的5%左右，是儿童和青少年最常见的一种恶性肿瘤。目前白血病的治疗大多以化疗为主，其作用是全身性的，毒副作用较强，因此，寻找高效低毒、抗瘤谱广、综合性能又好的植物来源的抗癌药是现在研究的重点。

体外抗肿瘤实验为抗肿瘤药物筛选过程必不可少的部分。利用体外肿瘤细胞培养和MTT法，以抑制肿瘤细胞增殖为活性指标，是目前一种快速、经济、简便、有一定特异性的药物筛选方法，在MTT法实验基础上采用集落形成能力试验、细胞计数、蛋白质或其他大分子物质含量测定，能客观地反映被测物质的药理作用。通过此方法，不仅可以发现有效的抗肿瘤药物，而且还可以从细胞水平和分子水平对抗肿瘤机制进行研究［4，5］。

本研究中，细胞毒试验（MTT法）实验结果显示，CN不同提取物对L1210细胞都有不同程度的抑制作用，且其抑制作用呈明显的剂量关系。其中CN正丁醇部位、CN多糖部位对L1210细胞的半数致死浓度（IC50）

参考文献

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1.无公害蔬菜生产现状分析

1.1砚山县生产无公害蔬菜的优势

1.1.1气候条件优越。砚山县地处北回归线附近的低纬高原地带，属北亚热带季风气候。冬无严寒，夏无酷暑，四季温和的自然立体气候（年平均降雨量在850～1400mm，气温在12.5～18.6℃，全年理论日照为4421小时，霜期一般在62天左右），全县境内四季均可生产无公害蔬菜。

1.1.2土地资源丰富。砚山县的土地资源是比较丰富的，可以生产无公害蔬菜基地133.3hm2以上的大小坝子35个，共有面积7.07万hm2，占全县土地总面积的18.4%。其中，平远、稼依坝子的面积达4.07万hm2，是全省名列第8的大坝子。目前砚山县生产无公害蔬达0.73万hm2，占蔬菜栽种面积的10.4%。

1.1.3水资源丰富。砚山县年总降水量40亿万m3，经流量14亿万m3，占总降水量的35%，目前可控制水量为1.4亿万m3，占径流量的10%。其中：有6条小河，总长224.7km；共有河道引水工程342件，拦河坝32道，泉水71处，箐沟239条。

1.1.4交通条件良好。砚山县地处323国道线上，又是内地向沿海地区提供蔬菜的必经之路，在路途上远比建水、通海等蔬菜产区占有优势。目前砚山县由于各种原因，生产不出更多的无公害蔬菜，致使虽然砚山的地理位置好，区位优势好，交通便利，但没有得到其应有的效应。

1.2无公害蔬菜生产存在的问题

近年来我国种植业产业结构得到不断调整，我国蔬菜种植面积每年都处于不断扩大的趋势，同时也使得各类病虫害逐年加重。需要考虑的是，我国作为一个科学技术水平相对落后的国家，在蔬菜的种植与生产过程中，不可能完全拒绝使用农药，尤其是近些年病虫害不断加重的情况下，不使用农药很可能导致减产、绝收。因此，我国菜农在农药的使用及管理上仍然存在较大的问题，具体有以下几点。

1.2.1农药经营台帐问题。一是部份农药经营户进货、销售台帐记录不规范、不全面；二是部份农药经营户没做进货、销售台帐记录；三是农药摆放不规范；四是极少数存在不及时清理、销毁过期农药。

1.2.2经费短缺。资金不足仍然是制约农药监督管理工作的主要因素。比如一年一度的年审、上岗人员的继续培训及材料、办证、换证等费用都是从其它款项的费用中支出。

1.2.3农药市场不规范。农药市场分散，农药经营户多，执法人员少，造成农药管理人员在农药管理过程中困难重重。比如：不能同时顾及外勤的农药市场巡查和内勤的换证、办证，以及材料的上报等工作（农药管理涉及食品安全、农产品质量、办证、换证、市场巡查等工作，需要上报的材料很多）。

2.植保技术在无公害蔬菜生产中的作用分析

2.1改善蔬菜生产环境、加大食品安全宣传

选择无公害蔬菜生产环境必须要提高土壤、土地的选择标准，同时通过加强周边水土资源管理等措施，确保农作物用水的安全性，防止由于工业用水对农业生产产生的污染问题。其次，对于不同品种、不同特性的蔬菜，要结合其生长要求改善周边环境，如土壤环境、水资源环境等，从而确保各项环境指标均能够满足无公害蔬菜的生长条件。另外，在灌溉系统当中，也要采用高科技的灌溉技术，确保蔬菜在用水方面得到保障。不仅如此，还应继续大力宣传农产品质量安全，无公害农产品及绿色食品生产的重要意义。强化重点，树立榜样，重点发展龙头企业、种养大户等有规模、上档次的企业，同时要让每个人认识到无公害、绿色食品生产对环境、资源、经济、社会发展良性循环的重要作用。

2.2物理及生物防治技术的应用

在无公害蔬菜种植过程中，物理技术可改善蔬菜生产环境，通过物理手段建立一套有利于蔬菜生长的环境，通过抑制害虫生长的物理技术来促进蔬菜的生长。物理技术主要有温度、颜色及光线等，如采用糖醋剂、紫光灯等措施来吸引、杀死害虫，起到减少农药使用乃至替代农药的良好效果。

生物防治技术主要是利用蔬菜生长的特性，促进蔬菜的生长，即根据蔬菜在生物链中的位置特点，营造出一种有利于蔬菜生长的环境。比如利用生物之间的对抗性，保证无公害蔬菜的种植与产量。但需要考虑的是，生物防治技术效果的体现需要一定的时间过渡，因此要想结合物理技术的应用，起到制约害虫、促进蔬菜生长还有必要结合物理技术来取得较为良好的效果。

2.3强化无公害蔬菜病虫害农药防治管理

一般来说，通过应用化学防治技术能够较大规模、较好效果地实现病虫害的控制及防治工作。但采用化学防治技术还应严格控制化学药品的用量、时间、品种、频率，使用最少的化学药品，取得最佳的防治效果。此外，还应该注意化学农药的残留、病虫害发生的规律等确定化学药品的使用，将病虫害控制在早期阶段，确保化学农药的使用能够体现出更加优良的效果。

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合作学习（cooperative learning）是一种以小组学习为形式，旨在促进学生合作，从而达到最佳学习效果的教学方法。它能改善课堂气氛，大面积提高学生的学业成绩，并且能满足学生的心理需要，促进学生情感的发展，已经广泛地受到世界各国的青睐，并成为当代主流教学模式，被越来越多的教师所认可并采用。

医学细胞生物学是我院大一新生第一学期开设的课程。由于医学细胞生物学是一门重要的医学基础课程，且为后续其它的基础医学和临床课程的学习搭建牢固的知识平台，因此，熟练掌握其基础理论、基础知识和实验技能，对医学院的学生来说十分必要。

一、合作学习教学模式的必要性

1.生物学基础知识参差不齐。

我院生源不统一，如护理、预防专业，招收的高中文、理科毕业生皆有，因此刚接触学习医学细胞生物学时，文科毕业生不太习惯这种知识体系，对学习医学细胞生物学相对倦怠和恐惧，容易产生抵触学习情绪，很大程度地影响了学习成绩。

2.传统的教学模式已经不适用于新兴人才的培养。

传统的以教师为“绝对中心”、滔滔不绝的“填鸭式”教学法，使学生失去以饱满状态进行持续听取整堂课的兴趣，学习气氛沉闷，学生学习的积极性和主动性得不到充分的调动和发挥，教学效果不敬人意。

合作学习教学模式以面向全体学生为原则，不仅有利于促进每个学生的发展，而且突出教学过程中学生的主体地位，能够充分调动学生的学习积极性，增强学生的学习效果和教师教学的实效性。因此在医学细胞生物学的教学中，以合作学习教学模式作为对传统教学模式的一种突破和补充，是十分必要的。

二、合作学习教学模式在医学细胞生物学课程中的应用

合作学习模式是一种责任分工学习模式，也是一种互助学习模式，是教师营造民主、平等的学习氛围，通过生生互动、师生互动的交流方式，充分发挥学生的主观能动性和学习潜能，齐心协力共同完成教学目标的一种教学模式。该模式由以下几个步骤构成。

1.学生自主合理划分小组，以小组为单位收集资料（课前）。

合作学习以学生为中心，其基本教学形式是小组活动。分组采取自愿原则，但必须兼顾“组内异质，组间同质”，即按照性别、兴趣爱好、知识基础、语言能力和学习能力等特征将整个班级平均分成若干组，每组6―8人。每组设一个组长，负责工作。组长可以由组内成员轮流担当。组内成员有男有女，有文有理，有强有弱。这样互补型的组内成员优化组合，不仅能使学生产生新鲜感，而且能增强学生的学生兴趣。

组内成员课前各自预习即上新内容（如小分子的跨膜运输），并相互协作通过课本、互联网、图书馆等途径收集即上新内容的相关资料，达到预习的功效。

2.教师课堂进行班级集体授课，制订教学目标（课堂20min）。

合作学习教学模式中的班级集体授课，是合作学习的一种前提准备，也是合作学习模式策略中必不可少的一个重要环节。在集体授课中，教师需要解决的任务有以下几个。

（1）激发兴趣。教师在计划时间内，高效讲授新的课程内容的基本点，以积极、振奋、饱满的情绪感染学生，用影视、图像、声音、动画与文字等多媒体信息进行授课，如各种小分子跨细胞膜膜转运的动画素材，感染学生的听课情绪，激发学生的听课兴趣。

（2）目标设计。做好合作学习的启动工作，根据讲授内容抓住重、难点，按照“从大到小”的原则提出在学生能力范围内的可操作性问题。如：“细胞膜是不是完全封闭的结构？”“是不是所有的小分子跨膜运输都需要膜转运蛋白?”“小分子跨膜运输都需要消耗ATP吗？”“小分子物质的跨膜转运主要分为哪两种？”

3.学生小组研究讨论，教师走动观察（课堂15min）。

各小组分别就所提出的问题，根据课前收集的信息和资料进行“主动参与、交流合作”的组内研究和讨论，由组长总结得出的结论。

教师在班级里走动观察各组讨论情况，及时表扬一些好的行为，鼓励一些胆小不爱表达的同学积极发表意见，及时将一些偏离主题的同学拉回正题上来。另外，如有必要，要让学生掌握一些必要的合作技能，如善于倾听别人的意见，在合作学习过程中要学会尊重，如有不同意见，应先保留，等对方讲完，再提出不同的见解。

这样能使每个学生都积极、平等地参与到问题的讨论中来，共同讨论，共同进步，既可以从别人那里获得宝贵知识，对所学知识产生深刻的认识，又能加强语言表达能力和发展人际交往能力。

4.师生共同总结工作（课堂10min）。

先由某一组组长汇报讨论结果，如“小分子跨膜转运主要有简单扩散、协助扩散和载体蛋白耗能介导的运输”。然后其他组组长作出评价和补充，如“简单扩散和协助扩散属于被动运输方式，载体蛋白介导的耗能运输是主动运输方式”。最后教师进行适当的诱导和启发，师生共同对本课所学内容进行归纳总结，达成一致共识，得出结论：小分子跨膜转运按照是否需要消耗能量被分为被动运输和主动运输。

5.建立奖励制度（课后）。

奖励合作学习中表现优异的小组，如分工最为明确的小组、最为团结互助的小组、最具发散思维的小组、最具创新能力的小组、言语最为精炼的小组等，形成“组内成员合作，组间成员竞争”的新格局，使每个同学都加强个人的责任感和团队意识。且每次得优的小组成员都会在平时分上加相应的分数，以资鼓励。

三、结语

合作学习教学模式在医学细胞生物学中的科学、合理应用，有利于学生对完整知识体系的构建，有利于激发学生的最大程度地发挥其主动学习的潜能，有利于学生从他人的思维中获得启发和创新思维，有利于学生培养团结合作的精神，有利于学生整体素质的全面提高，有利于建立和谐、平等的师生关系和生生关系，有利于教师发现自身存在的知识和能力不足，有利于教学质量的不断改进。像这样“师生共同进步、共同分享教育成果”，才是教育的真谛。

参考文献：