关键词：大鼠心肌细胞 缺氧损伤 脂质体转染 心肌细胞凋亡 心血管疾病 

摘要：目的许多研究表明,心肌细胞的凋亡与心衰和冠心病等心血管疾病关系密切。另外有研究表明,ROCK1(Rho-associated coiled-coil protein kinase-1)和ROCK2的表达下调可抑制某些细胞的凋亡。为此,我们将靶向ROCK1和ROCK2基因的shRNA转染大鼠心肌细胞,以沉默ROCK1和ROCK2的表达,探讨ROCK1和ROCK2在缺氧致心肌细胞凋亡中的作用。方法 (1)原代培养大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。(2)构建并鉴定靶向大鼠ROCK1和ROCK2基因的重组质粒ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA各3个。(3)用脂质体转染法将ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA瞬时转染心肌细胞,48 h后提取蛋白,用Western Blotting检测ROCK1和ROCK2蛋白的表达量,并筛选出沉默效率最高的shRNA。(4)将沉默效率最高的ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA瞬时转染心肌细胞,48 h后给予缺氧6 h处理。实验分为5组:①空白对照组;②缺氧组;③缺氧+阴性对照shRNA组;④缺氧+ROCK1-shRNA;⑤缺氧+ROCK2-shRNA组。缺氧结束后,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况。(5)转染和缺氧处理后收获细胞,用Western Blotting检测Caspase3、p-PI3K和PI3K的表达情况,用倒置显微镜观察心肌细胞搏动频率与节律,用全自动生化分析仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,用MTS检测细胞存活率,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 (1)鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功。(2)Western Blotting的结果显示,shRNA转染能有效抑制ROCK1和ROCK2基因的表达,其中ROCK1-shRNA1和ROCK2-shRNA2的沉默效率最高。(3).荧光显微镜发现,在转染了ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功。(4)缺氧损伤后心肌细胞搏动频率较对照组明显减慢,搏动幅度减弱,节律不规整,而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。(5)全自动生化分析仪检测发现,缺氧能导致细胞培养液LDH含量升高,而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的

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