生物技术通讯杂志

用聚乙烯亚胺反向转染siRNA表达盒进行RNA干扰的研究

关键词: sirna表达盒  反向转染  聚乙烯亚胺  绿色荧光蛋白  rna干扰  

目的：建立适用于大规模RNA干扰（RNAi）筛选的siRNA生成与导入技术.方法：以绿色荧光蛋白（GFP）为模型,用PCR方法生成了包含U6启动子、互补的反义链和正义链以及终止序列的特异性siRNA表达盒（SEC）,对聚乙烯亚胺（PEI）介导的转染SEC的方法及其效率进行研究.结果：PEI对细胞的毒性呈剂量依赖关系,当PEI与DNA的N/P=7.53,即PEI与DNA等量时,转染...

SARS冠状病毒核衣壳蛋白抑制胞质分裂和细胞增值

关键词: sars冠状病毒  核衣壳蛋白  定位  多核细胞  

目的：SARS冠状病毒（SARS-CoV）的核衣壳蛋白（N蛋白）能够结合病毒RNA形成螺旋状的核衣壳.在3种不同的细胞系中分别表达SARS-CoV N蛋白,研究它对转染细胞生长的影响.方法：将重组质粒pEGFP-N和pEGFP（作为对照）分别转染人胚肾HEK293细胞、成纤维细胞3T3、人宫颈癌HeLa细胞,通过激光共聚焦显微镜、荧光显微镜观察SARS-CoVN蛋白在细胞内的定位...

HIV-1 tat基因改造及其蛋白表达、纯化与抗体制备

关键词: tat基因  tat蛋白  原核表达  多克隆抗体  

目的：为了方便实验室工作中HIV-1 B＇/C亚型及C亚型Tat蛋白的检测,制备了相应的Tat蛋白及其抗体.方法：将我国HIV-1 B＇/C亚型流行株tat基因的第1个外显子和HIV-1 C亚型tat基因的第2个外显子融合在一起,将密码子替换为大肠杆菌的优势密码子,通过合成引物、PCR拼接的方法,获得目的基因序列;在原核系统中与pET32a＋载体中的His·Tag、Trx·Tag及S·T...

外源表达的人copine V诱导细胞死亡的研究

关键词: copine  v  基因转染  细胞死亡  

目的：copines蛋白家族是新近发现的一类分布广泛、进化保守的Ca2＋依赖性磷脂结合蛋白,copineV是其成员之一.为研究copineV基因的功能,构建了人copineV基因的真核表达质粒并转染HEK293细胞,以进一步研究其功能.方法：构建人copineV编码区序列的真核表达质粒pCDNA4/copineV,脂质体法转染HEK293细胞.通过RT-PCR、克隆形成实验和Hochesst33342染色...

copine V蛋白的亚细胞定位

关键词: copine  v蛋白  亚细胞定位  内质网  线粒体  细胞膜  

目的：确定copine V蛋白的亚细胞定位,初步研究该蛋白的生物学功能.方法：将copine V编码区基因分别构建真核表达载体pEGFP-copine V（或pRED-copine V）,转染HEK293、HeLa细胞,在激光共聚焦荧光显微镜下与转染空载体pEGFP-N1（或pRED-N1）的细胞比较观察.结果：经限制性内切酶分析鉴定,构建的重组表达载体正确.通过激光共聚焦荧光显微镜观察,转...

凋亡诱导因子与非受体酪氨酸激酶c-Abl的相互作用

关键词: 凋亡诱导因子  

目的：研究凋亡诱导因子（apoptosis-inducing fctor,AIF）与非受体酪氨酸激酶c-Abl的相互作用及其功能.方法：应用免疫共沉淀法研究蛋白质的相互作用;用抗磷酸化酪氨酸抗体研究蛋白质的体内磷酸化;与GFP质粒共转染研究蛋白在细胞内的表达量.结果：AIF与c-Abl在细胞内能形成复合物;AIF可以被c-Abl磷酸化,且c-Abl能提高AIF的表达量.结论：AIF与c-...

前列腺癌细胞结合单链抗体的克隆表达及其功能初步研究

关键词: 前列腺癌细胞  单链抗体  肿瘤抑制  

目的：在获得纯化的前列腺癌细胞结合单链抗体scFv P-9后,对其生物学功能进行初步探讨,为前列腺癌的诊断和治疗奠定基础.方法：利用MTT比色实验初步研究了scFv P-9对多种肿瘤细胞及正常肝细胞HL02的生物学作用,并建立人宫颈癌的裸鼠模型,进行了抑瘤实验.结果：scFy p-9不影响HL02细胞及恶性程度低的人前列腺癌细胞LNCaP的生长,但对人前列腺癌细...

甘蔗花叶病毒E株系外壳蛋白基因原核表达载体的构建与表达

关键词: 甘蔗花叶病毒  外壳蛋白基因  原核表达  

目的：用原核表达的方法获取大量带6个His标记的甘蔗花叶病毒E株系（ScMV-E）外壳蛋白（CP）.方法：用带有BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点的特异引物,以带有多个基因的重组质粒pNUSCP为模板,扩增出片段长度为942 bp的ScMV-E外壳蛋白基因,亚克隆到pMD18-T载体上,转化E.coli DH5α,经双酶切检测获得阳性克隆.BamH Ⅰ和SalⅠ双酶切阳性克隆质粒,回收目的片...

ESAT6-CFP10融合蛋白基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

关键词: esat6基因  cfp10基因  融合表达  耻垢分枝杆菌  重组疫苗  

目的：构建能表达ESAT6-CFP10融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗.方法：以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp 10基因,将其插入到pGEM-T-easy载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp 10融合基因的重组载体pGEM-e6c10.酶切消化pGEM-e6c10重组质粒,将esat6-cfp 10基因亚克隆到pDE22分泌表达穿梭载体,以电穿孔方法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌...

具有抗HIV活性的天花粉蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

关键词: 天花粉蛋白  人类免疫缺陷病毒  原核表达  纯化  

目的：天花粉蛋白（TCS）有较强的抗HIV活性.利用基因工程技术在大肠杆菌中表达TCS并进行纯化.方法：从新鲜栝楼叶片中获取TCS基因组DNA,利用PCR技术扩增其全长基因,经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后与原核表达载体pRSET-A连接,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序;将所获阳性重组质粒转化感受态E.coli BL21（DE3）得到工程菌,经IPTG诱...

VEGF121-KLAK融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达及纯化

关键词: vegf121  两性分子  融合蛋白  

目的：在大肠杆菌中高效表达并纯化VEGF121与两性分子KLAK的融合蛋白,为进一步研究其抗肿瘤血管形成作用奠定基础.方法：用RT-PCR法扩增目的基因,插入表达载体pET28a后,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达重组蛋白,对产物进行SDS-PAGE及Westem印迹分析.结果：克隆出目的基因,构建了融合蛋白表达载体,诱导表达后经SDSPAGE检测表明获得了目的...

FHL家族的克隆及其融合蛋白的纯化

关键词: fhl  克隆  融合蛋白  

目的：纯化FHL家族（FHL1～FHL5）融合表达蛋白.方法：用PCR方法从乳腺文库和卵巢文库中扩增FHL1～FHL5编码序列,将其以正确相位与pGEX-KG载体中的GST编码序列融合,将重组质粒分别转化E.coli DH5α后,用谷胱甘肽-Sepharose 4B纯化融合蛋白,并用Western blot检测融合蛋白的表达.结果：构建得到FHL1～FHL5的融合表达载体,West-ern blot检测表明GST-...

GST-IL-21融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性测定

关键词: 人白细胞介素21  原核表达  生物学活性  

目的：克隆人白细胞介素21（IL-21）编码区的cDNA,在大肠杆菌中得以表达,并检测其促进人外周血单核细胞（PBMC）增殖的生物学活性.方法：利用基因工程技术,以植物血凝素（PHA）刺激的人扁桃体细胞cDNA文库为模板,经PCR扩增获得IL-21的编码基因,并将其重组于表达载体pGEX4T-2中,转化大肠杆菌DH5α进行诱导表达,纯化得到GST-IL-21重组融合蛋白;MTI...

重组干扰素-τ在大肠杆菌中的表达与纯化

关键词: 大肠杆菌  温控诱导表达  蛋白质纯化  

目的：探讨干扰素（IFN）-τ在大肠杆菌中的表达及纯化.方法：含有IFN--τ基因的pBV220表达质粒转化大肠杆菌BL21,于42℃温控诱导重组菌表达IFN-τ.经过包涵体溶解、DEAE离子交换层析、硫酸铵沉淀及梯度透析,使重组IFN-τ获得纯化和复性.结果：诱导后的表达产物经SDS-PAGE分析,有相对分子质量约21 000的条带.纯化复性后目的蛋白纯度可达90%.结论：工...

B型肉毒毒素重链抗原表位的预测及表位合成肽抗原性的检测

关键词: 肉毒毒素  表位  合成肽  

目的：预测B型肉毒毒素蛋白抗原表位,研究表位合成肽的生物学活性.方法：利用生物信息学,结合Anthwine分析软件及网络平台,预测B型肉毒毒素蛋白重链的B细胞抗原表位.人工合成4条（P1,P2,P3,P4）表位多肽,与抗B型肉毒毒素类毒素的马血清反应;采用腹腔注射的方式用合成肽免疫BALB/c小鼠,检测免疫血清与合成肽的结合;对免疫小鼠腹腔注射B型肉毒毒素...

新疆褐牛中4种微卫星DNA标记的初步研究

关键词: 微卫星dna标记  新疆褐牛  

目的：探讨4种微卫星标记在新疆褐牛中的多态性.方法：选择了4个微卫星DNA标记,通过PCR扩增和聚丙烯凝胶电泳的方法,分析它们在新疆褐牛中的多态分布情况.结果：4个微卫星标记的等位基因数分别为8、7、7和7,多态信息含量值（PIC）分别为0.813 5、0.789 3、0.794 7和0.697 5.实验数据提示,4个微卫星位点的若干等位基因,分别与前管围、腰角宽、臀...

反义磷脂酶Dγ基因转化小麦的研究

关键词: 小麦  反义磷脂酶d  转化  

目的：获得抗寒、耐盐等能力增强的小麦新种质或新品种.方法：利用穗茎注射法将含有反义磷脂酶D γ基因（PLDγ）的根癌农杆菌菌液注入到春小麦富硒乌麦旗叶鞘内,T1代经田间表型选择筛选到10株变异株,通过特异PCR扩增和Southern杂交技术对获得的变异株进行分子检测,并对转基因植株进行耐盐性鉴定.结果：变异株均扩增出大小为430bp的目的片段,South...

不同基因型棉纤维α-微管蛋白基因的特异性分析

关键词: 纤维发育  基因特异性  

目的：探讨α-微管蛋白基因与棉纤维发育的关系,为利用基因工程培育棉花新品种提供理论依据.方法：利用PCR与测序技术相结合的方法,对4个纤维品质差异较大、基因型不同的棉纤维α-微管蛋白基因进行序列分析.结果：4个品种均得到了1条约250 bp的电泳谱带,对其测序发现品种之间存在不同程度的差异.结论：α-微管蛋白基因的保守性很强,只存在个别碱基...

D-核糖生产菌的原生质体诱变及其发酵培养

关键词: 枯草芽胞杆菌  原生质体  诱变  发酵  

目的：筛选出莽草酸、转酮醇酶双重营养缺陷型的D-核糖生产菌枯草芽胞杆菌,以提高D-核糖的产量.方法：采用化学诱变剂乙基磺酸甲烷（EMS）对野生型D-核糖生产菌的原生质体进行诱变,并从D-核糖合成途径对发酵培养基进行优化设计.结果：摇瓶发酵D-核糖平均产量为52.2g/L;获得的B.sems-10菌株具有良好的遗传稳定性,D-核糖产量高达67.5g/L.结论：通...

红枫增殖生长培养基配方研究

关键词: 红枫  增殖培养  培养基  

目的：研究红枫组织培养中增殖阶段的培养基,以期筛选出最适增殖培养基配方,为最终建立红枫无毒快繁体系奠定基础.方法：以MS培养基为基本培养基,附加不同浓度的CPPU和6-BA,并以食用白砂糖代替分析纯蔗糖,对红枫进行增殖培养,比较生长状况.结果：CPPU和6-BA均能促进红枫单芽茎段的腋芽增殖,其中以CPPU的效果较好.结论：最适增殖培养基为（MS,30g...

原子力显微观察巯基反应剂对乙酰胆碱酯酶立体结构的影响

关键词: 乙酰胆碱酯酶  原子力显微镜  构象  

目的：研究巯基及二硫键对乙酰胆碱酯酶（AChE）高级结构的作用.方法：将与巯基反应剂GSH和DTT作用前后的AChE重组到磷脂膜上,置于原子力显微镜下观察,扫描方式为空气中接触模式.结果：天然的AChE直径不均一,既有大粒子也有小粒子,平均最大直径（95±44）nm,平均半径（43±17）nm,平均高度（9.25±2.62）nm;与GSH反应后的AChE整体粒径明显变小,最大...

一种构建多拷贝串联小分子多肽基因的方法

关键词: 锯鳞蝰血抑环肽  串联基因  表达  

目的：构建蛇毒锯鳞蝰血抑环肽（Ecs）基因串联多拷贝重组质粒.方法：采用重叠延伸PCR克隆Ecs基因,将第28位Met的密码子突变为Leu,利用其序列特点及酶切位点,在表达载体pET30a上将Ecs基因以同向串联方式连接,在E.coliBL21（DE3）中表达产物.结果：工程菌表达的串联Ecs与预期结果相符,实现了Ecs基因的串联表达.结论：为活性小肽的体外表达提供了...

一种改进的烟草多酚氧化酶Ⅱ纯化方法

关键词: 烟草  多酚氧化酶  分离  纯化  

目的：选择不同的分离、纯化步骤并比对分析,筛选出纯化烟草中多酚氧化酶（PPO）的优化组合方案.方法：采用分段盐析、DEAE-Sepharose Fastflow和Sephadex G-150柱层析纯化PPO,通过测定和比较酶活性筛选最佳条件.结果：确定了最佳盐析浓度（40%）和柱层析条件,SDS-PAGE、FPLC以及动力学常数的检测结果表明,纯化出的蛋白质相对分子质量为42 000,K...

定量检测组织型纤溶酶原激活剂夹心ELISA方法的建立

关键词: 定量检测  组织型纤溶酶原激活剂  elisa双抗体夹心法  

目的：建立灵敏、特异的组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）定量测定方法,为血栓性疾病和肿瘤性疾病的早期诊断及疗效评估提供辅助手段.方法：采用抗t-PA多克隆抗体包被酶联板、HRP标记抗t-PA单克隆抗体为标记抗体、重组t-PA为标准品,建立定量测定t-PA的夹心ELISA双抗体法.以t-PA测定的特异性、灵敏性和重复性评价夹心ELISA测定法.结果：夹心ELISA测...

医学分子生物学实验技术学习班

一种水稻幼苗单株DNA的快速提取及PAGE银染改良法

关键词: 水稻  dna提取  ssr  聚丙烯酰胺凝胶电泳  银染  

目的：为了提高SSR分子标记技术在水稻遗传育种中的研究效率,介绍一种快速的适于SSR-PCR扩增的水稻幼苗单株DNA提取法及PAGE银染法.方法：在常温下加入少量SDS提取液将单株叶片迅速捣碎,再加入300μL SDS提取液,65℃水浴10 min后离心,取上清用乙醇沉淀后离心,超净工作台吹干后用100μL TE回溶即可.改进的PAGE银染法只需染色、冲洗、显影等3步,用乙...

“中国遗传学会功能基因组学研讨会”征文通知

双杂交和质谱技术在蛋白质-蛋白质相互作用研究中的应用

关键词: 酵母双杂交  细菌双杂交  哺乳动物细胞双杂交  

基因的功能是由蛋白质来执行的,而蛋白质要通过与其他生物分子相互作用来完成其各种生物功能.因此,如果能够快速做出蛋白质在不同时间、空间和不同环境中的相互作用图谱,就会帮助我们了解这些蛋白质的功能,进而了解许多生命活动的机制.目前,用于大规模研究蛋白质间相互作用的方法主要有酵母双杂交系统及其衍生系统、亲和纯化与质谱分析联用技术,...

前列腺特异启动子和部分靶基因在转基因模型中的应用进展

关键词: 前列腺癌  启动子  靶基因  转基因模型  

遗传工程小鼠模型已被大量用于前列腺癌发生、发展、恶化和转移的研究.构建小鼠模型的途径主要包括转基因的过表达、基因敲除或敲入,以及使用Cre/lox技术进行条件调控.本文综述了目前构建的有明显遗传表型的转基因小鼠模型所用到的前列腺特异的启动子,以及所用到的靶基因.

“睡美人”转座子系统研究进展

关键词: 转座  转基因  

转座子在脊椎动物中的应用远落后于在其他生物系统中的应用.“睡美人”转座子（sleeping beauty transposon）是Tcl/mariner转座因子超家族中的一员,是存在于鲑鱼基因组中的1个已经失活的转座子.1997年,Ivics等将这个转座子进行重建并恢复了它的活性.短短几年内的有关研究表明,“睡美人”转座子是目前在脊椎动物中转座活性最高的转座子.结合该转...

黄病毒属病毒复制子载体研究进展

关键词: 黄病毒属病毒  rna复制子  新型疫苗  复制机制  

RNA复制子是一种能自主复制的RNA载体,保留了病毒非结构蛋白（复制/转录酶）基因,而结构蛋白基因缺失或由外源抗原基因替代,复制/转录酶可控制载体RNA在细胞质中高水平复制以及外源基因的高水平表达.在黄病毒属病毒感染性克隆基础上,其复制子载体得到了成功的构建.黄病毒属病毒复制子为病毒基因组结构功能研究、表达载体构建、假病毒包装及新型...

蛋白转导域研究进展

关键词: 蛋白转导域  跨膜转运  机制  应用  

蛋白转导域（PTDs）是小分子多肽,又称为细胞渗透性蛋白（CPP）或转膜序列（MTS）,它可以不依赖于经典的细胞内吞,将多种大分子物质导入细胞内.因此,PTDs被认为是一种理想的运载工具,在将蛋白和其他分子导入活细胞的研究中有着广泛的应用前景.本文着重综述PTDs的跨膜转运机制及其应用等方面的研究进展.

基因工程重组蛋白胞外分泌Ⅰ型系统的研究进展

关键词: 重组蛋白  胞外分泌  hlya分泌系统  rsaa分泌系统  

在基因工程领域,重组蛋白表达后定位于胞内或周质间隙,影响了其表达水平与可溶性,进而影响活性,降低了利用效率.分泌表达至胞外培养基则能较好地解决这一难题.利用细菌天然分泌系统作为重组蛋白胞外递送工具已日益成为生物工程及相关领域的常用策略,其中Ⅰ型分泌系统是研究最多、最具应用前景的.本文简要综述典型的大肠杆菌α-溶血素（HlyA）分泌...

SARS冠状病毒核衣壳蛋白的研究进展

关键词: sars冠状病毒  核衣壳蛋白  亚定位  生物学功能  

核衣壳蛋白（N蛋白）是SARS冠状病毒（SARS-CoV）的结构蛋白,与病毒RNA结合形成核衣壳,是主要的抗原分子.最近的亚定位研究表明,它主要定位到细胞质,核仁内也有较少的分布.SARS-CoVN蛋白参与SARS-CoVRNA合成的调控以及核衣壳的形成,并能结合人亲环素（hCypA）解离病毒核心,激活AP-1信号转导途径,类泛素蛋白化干扰宿主细胞分裂,在缺乏生长因子的...

癌基因和抑癌基因研究进展

关键词: 癌基因  抑癌基因  肿瘤  

癌基因和抑癌基因的发现和研究是肿瘤研究史上的一个里程碑,标志着肿瘤研究进入了分子时代,从而在更深层次上为阐明基因的结构、表达、调控、功能的改变与肿瘤形成的关系提供了科学依据和可能性,具有重要的理论和实际意义.本文概述了癌基因和抑癌基因的最新研究进展.

丙型肝炎病毒细胞培养系统研究进展

关键词: 丙型肝炎病毒  复制子  细胞培养  

由于缺少丙型肝炎病毒（HCV）细胞培养系统,因此对其生活周期、感染机制至今仍不十分清楚,严重阻碍了相关治疗药物的研制.HCV复制子仅能在Huh7等极少数细胞中短暂复制且量低.1999年建立了亚基因组复制子,使人们有机会对其进行深入研究,但须人为引入碱基突变.最近建立的全基因组复制子无须引入突变且可形成病毒粒子,是一项重大突破.本文概述了HCV...

血管生成素的结构与功能的研究进展

关键词: 血管生成素  血管生成  核糖核酸酶  细胞表面结合位点  核定位序列  

血管生成素（angiogenin,ANG）是一种有效的血管生成因子,是RNase超家族中惟一具有促血管生成能力的成员,也是目前已知的所有血管生成因子中独具核糖核酸酶活性的因子.ANG具有3个功能元件,即RNase活性中心、细胞表面结合位点及核定位序列.ANG参与血管生成的各个阶段,是其他血管生成因子诱导新血管生成的枢纽,其作用受到受体调节.在肿瘤的发生、...

血管特异性体内噬菌体展示：靶向治疗应用

关键词: 噬菌体展示  筛选  靶向  血管  内皮细胞受体  

血管内皮上可表达不同的受体,采用噬菌体展示的方法已筛选出了一些靶向于组织特异性内皮细胞受体的肽或抗体.这些肽或抗体可用于生成靶向治疗复合物或影像试剂.目前,筛选方法包括体外途径、动物模型和患者体内途径.绘制血管的＂功能图谱＂,将在临床上有利于对癌症或其他显示特殊血管特性的疾病进行治疗.

噬菌体抗体库研究进展

关键词: 噬菌体展示  抗体库  

治疗性抗体的发展经历了异源抗体、人源化抗体和人源性抗体几个阶段.目前,人源性抗体是治疗性抗体发展的主要方向,而噬菌体抗体库技术的出现为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台,并且逐渐成为目前获得人源性抗体的主要手段之一.噬菌体抗体库技术是20世纪90年代初期抗体工程领域的一项重大进展,它是噬菌体展示和抗体库2种技术的集成,目前广泛...

抗体靶向超抗原的抗肿瘤作用研究进展

关键词: 超抗原  抗体靶向  抗肿瘤  

作为一种强大的T细胞激活剂,超抗原具有激活T细胞杀伤HLA-DR＋肿瘤细胞的能力,但这种杀伤作用无特异性.抗体靶向超抗原通过抗肿瘤抗体与超抗原偶联,既具有超抗原活性,又具有肿瘤靶向性,从而可以选择性地结合到目标细胞,进行有效的特异性杀伤,因此,抗体靶向超抗原在肿瘤的生物治疗领域具有广泛的应用前景.