关键词：重组耻垢分枝杆菌 巨噬细胞 

摘要：目的 构建一种可表达特异性10-23脱氧核酶（deoxyribozyme,DZ）的巨噬细胞靶向性细菌载体疫苗,并鉴定其在巨噬细胞表达10-23DZ的能力以及抑制靶基因表达的效果.方法 采用亚克隆方法将分枝杆菌复制子oriM克隆入10-23DRz真核表达载体pSDE01中,获取可在分枝杆菌和真核细胞中穿梭的重组质粒pSDE02.在前期研究基础上选择一有效的针对巨噬细胞taco基因的10-23DZ--DZ1,根据DZ1序列设计并制备DZ1的双链表达序列,插入pSDE02中获取重组质粒pDZM01.将pDZM01经电穿孔方法转化入耻垢分枝杆菌Ms1-2c株构建重组耻垢分枝杆菌rMS-DZ1.分别采用Ziehl-Heelson染色法和直接荧光观测法鉴定重组耻垢分枝杆菌的巨噬细胞靶向性.用rMS-DZ1感染巨噬细胞株RAW264.7,分别于感染后的24 h和48 h采用斑点杂交方法检测rMS-DZ1在巨噬细胞中表达DZ1的情况,再分别采取RT-PCR和免疫印迹方法检测巨噬细胞TACO表达的差异.结果 限制性内切酶酶切、菌落PCR及测序结果显示pSDE02、pDZM01和rMS-DZ1构建成功.rMS-DZ1感染RAW264.7细胞后24 h和48 h,经点杂交方法均检测到了DZ1的表达.半定量RT-PCR和免疫印迹检测结果显示,与未感染组比较,rMS-DZ1感染后24 h和48 h时巨噬细胞TACOmRNA分别下降了67.90%和57.14%,TACO蛋白水平分别下降了53.85%和68.92%.同时,表达对照寡脱氧核糖核苷酸DZ1U的重组耻垢分枝杆菌rMS-DZ1U感染RAW264.7细胞后,其TACOmRNA和TACO蛋白水平与未感染组比较均无明显差异.结论 本研究成功构建了一种可表达特异性10-23DZ的巨噬细胞靶向性重组耻垢分枝杆菌的载体,可在巨噬细胞内表达并抑制相应靶基因的表达,可作为研制治疗用疫苗的基础,这也是国内外首次报道可表达10-23DZ的细菌性载体.

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